探秘蛋白質(zhì)從頭測序技術(shù)的原理與流程

蛋白質(zhì)從頭測序(De Novo Sequencing)是指不依賴于任何已知蛋白質(zhì)或核酸數(shù)據(jù)庫，僅依賴于實驗數(shù)據(jù)，來確定蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列的技術(shù)。這種技術(shù)在新蛋白質(zhì)或修飾蛋白質(zhì)的鑒定中尤為重要。

一、原理：

從頭測序通常利用質(zhì)譜技術(shù)（MS）。蛋白質(zhì)或多肽在質(zhì)譜儀中被電離，產(chǎn)生正離子。這些離子在碰撞細胞中與碰撞氣體（例如氬氣）產(chǎn)生碰撞，使多肽或蛋白質(zhì)分裂成一系列的小片段離子。這些碎片離子的質(zhì)譜被稱為串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。MS/MS中的碎片離子是由于蛋白質(zhì)或多肽的肽鍵斷裂形成的，所以其質(zhì)量差表示了兩個相鄰的氨基酸殘基的質(zhì)量。

二、流程：

1.樣品準備：

提純的蛋白質(zhì)或多肽樣品被準備好并通過適當?shù)姆椒ㄋ腿胭|(zhì)譜儀中。

2.電離：

使用電噴霧電離(ESI)或激光解吸/電離飛行時間（MALDI-TOF）技術(shù)，將蛋白質(zhì)或多肽電離成離子。

3.質(zhì)譜分析：

首先通過質(zhì)譜儀測量蛋白質(zhì)或多肽的母體離子的m/z值，然后選擇特定的母體離子進行進一步的碰撞以產(chǎn)生碎片離子。

4.串聯(lián)質(zhì)譜分析：

母體離子在碰撞細胞中與碰撞氣體產(chǎn)生碰撞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或多肽分裂并形成一系列的碎片離子。這些碎片離子的m/z值被測量，并由此得到串聯(lián)質(zhì)譜。

5.數(shù)據(jù)分析：

使用專門的軟件，如Mascot、PEAKS等，對串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，通過比對碎片離子之間的質(zhì)量差異來推斷原始蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列。

6.驗證：

通過其他實驗方法，如Edman降解法或合成對應(yīng)的多肽進行驗證。

圖1

蛋白質(zhì)從頭測序技術(shù)的發(fā)展在很大程度上受益于質(zhì)譜技術(shù)的進步。隨著儀器靈敏度和分辨率的提高，以及數(shù)據(jù)處理軟件的進步，這一技術(shù)在蛋白組學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用將更為廣泛。