用于探索纖維化過程和治療干預的心臟組織修復新工程模型研究

研究背景：
缺血性心臟病（IHD）影響廣泛，死亡率高，其源于心肌損傷導致的病理重塑，引發(fā)心律失�；蛐牧λソ�。急性心肌梗死后分三階段，凋亡心肌細胞引發(fā)炎癥，心臟成纖維細胞活化，纖維化瘢痕取代受損心肌。纖維化瘢痕不僅導致存活心肌機電耦合降低，還易引發(fā)傳導阻滯，產(chǎn)生折返電脈沖，導致心律失常。人多能干細胞衍生的心臟譜系細胞，包括心肌細胞（CM）、心臟成纖維細胞（CF）、心外膜細胞和內皮細胞等，為制造可體外再現(xiàn)成年心肌結構和電生理特征的人類工程心臟組織（hEHT）提供了充足的細胞保障。球形心臟類器官可以作為 3D 心肌組織來模擬心臟發(fā)育和疾病。目前已有模型取得進展，但仍需能準確代表心肌損傷重塑過程與功能性障礙結果的體外模型。

基于此，湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室張冬卉教授團隊與上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心張浩教授團隊發(fā)表了題目為：“Engineered model of heart tissue repair for exploring fibrotic processes and therapeutic interventions”的文章。

研究開發(fā)了一種基于 hEHT 的心肌損傷修復模型，其重塑過程包括早期 CM 凋亡和結構損傷（0-2天），以及 CF 激活的纖維化瘢痕形成期（2-4天），第 6 天重塑區(qū)域出現(xiàn)電生理功能障礙，表現(xiàn)為鈣波傳導和活性降低。通過單細胞轉錄組學分析鑒定心肌損傷修復過程中的以心肌細胞與心臟成纖維細胞為代表的細胞命運轉變與關鍵信號調控。

接著，在“迷你” hEHT 損傷修復模型中評價十七種信號通路調節(jié)劑，以評估它們對心肌重塑的影響。結果表明，SB431542（TGFβ 抑制劑）、Y27632（ROCK 抑制劑）和 CHIR99021（WNT 激活劑）可防止重塑區(qū)域的過度纖維化并促進心肌細胞的原位修復。同時在 hEHT 損傷修復模型中和小鼠心肌梗死（MI）模型中，進一步證實 SB431542（TGFβ 抑制劑）、Y27632（ROCK 抑制劑）和 CHIR99021（WNT 激活劑）根據(jù)重塑進展的階段性干預具備更好的促損傷心肌功能性再生的效果�？傊�，hEHT 修復模型可模擬心肌重塑、闡明 MI 后電生理功能障礙，有助于篩選治療 IHD 潛在抗纖維化和心臟再生藥物靶點。

研究方法：
本文采用熒光標測技術（Optical Mapping）來檢測不同模型組的鈣瞬變信號。在人類器官模型（hEHT）以及小鼠、大鼠心梗模型中，通過該技術直觀地描繪出類器官、整體心臟的生理指標變化，為心肌損傷修復機制以及評估藥物治療效果提供了重要的檢測手段。

研究結果：
1、體外建立 hEHT 損傷修復模型
通過將人多能干細胞來源心臟譜系細胞封裝在纖維蛋白 - 基質膠水凝膠中，形成 hEHT 。隨后利用低溫損傷裝置，建立了 hEHT 損傷修復模型，該模型能模擬 MI 后損傷心肌的階段性重塑，包括細胞凋亡、CF 激活和纖維化瘢痕形成等，且能觀察到 CF 遷移和 ECM 分泌，以在后期瘢痕形成期間填充損傷區(qū)域。（圖1）

圖1. hEHT 損傷修復模型的建立

2、hEHT 損傷修復模型在纖維化瘢痕形成后表現(xiàn)出與心律失常相關的電生理功能障礙
其次，心肌梗死（MI）通常會通過損害 CM 功能和誘導纖維化來引發(fā)心律失常，阻礙心臟電信號傳播。利用光標測技術(Optical Mapping)，對重塑后的 hEHT 進行光學標測，以研究損傷后第 6 天重塑區(qū)域周圍組織水平的鈣波傳播異常。研究結果表明，重塑區(qū)域中 CF 的填充增加超過 CM，導致異常的鈣活動，從而導致傳導阻滯。這些傳導緩慢或傳導阻滯的區(qū)域將增加整個 hEHT 中觸發(fā)折返性心律失常的風險。大鼠 MI 模型也有類似電生理功能障礙，這表明 hEHT 修復模型能展示 MI 的損傷發(fā)作、纖維化發(fā)展和功能障礙過程，模擬其時空景觀。

圖2. 重塑后的 hEHT 存在局部鈣活性異常
 

3、hEHT 損傷修復模型在重塑過程中由多樣化的細胞組成
為闡述損傷心肌修復過程中的細胞命運轉化與關鍵信號調控，對處于自修復早期與晚期階段的損傷 hEHT 分別進行了單細胞轉錄組測序。分析結果表明，hEHT 中存在4種主要細胞類群，包括心肌細胞、心臟成纖維細胞、內皮祖細胞、心外膜細胞，心肌細胞與成纖維細胞，可進一步分辨為不同亞群。冷凍損傷激活早期心肌細胞，特別是非成熟心肌細胞亞群的缺氧應激反應及之后的代謝轉變。而心臟成纖維細胞作為心肌病理性重塑的主要原因，損傷增強其向肌成纖維細胞的轉化與 ECM 分泌能力。偽時序分析進一步描繪上皮樣成纖維細胞 (VIM+/CD44+/CXADR+) 向過渡態(tài)(VIM+/CD44+/CXADR-)演化，進而轉變?yōu)榛钴S態(tài)成纖維細胞(VIM+/CD44-/CXADR-, αSMA+) 的細胞命運。免疫熒光結果驗證上述心臟成纖維細胞亞群在非損傷區(qū)與重塑區(qū)的空間異質性，同樣也發(fā)現(xiàn)心外膜細胞 (WT1+) 對于重塑的貢獻，暗示上述細胞亞群在心肌病理性重塑進程中的命運聯(lián)系，以及 CD44 對于心臟成纖維細胞命運轉變的指示作用。（圖3、圖4）

圖3. 損傷的 hEHT 在重塑過程中的亞細胞組成和信號動態(tài)的轉錄組分析
 

圖4. 偽時序分析顯示，hEHT 損傷修復模型中的 CF 在體內表現(xiàn)出相似的細胞命運轉變
 

4、用于快速篩選缺血性心臟病潛在治療靶點的“迷你” hEHT 損傷修復模型
利用 3D 打印制造類似 PCR 管結構的支架用于批量成型直徑約 4 毫米的“迷你” hEHT，通過特定底座可進行批量均勻低溫損傷，其對損傷反應與 hEHT 一致。使用該模型可評估來自主要涉及到 ROCK、WNT、TGFβ、cAMP、PI3K、ERK、NFκB、前列腺素 E2、成纖維細胞生長因子共 9 種信號通路的十七種調節(jié)劑的促修復作用，其中一些調節(jié)劑顯著加速重塑。不同調節(jié)劑以不同方式加速重塑，表明它們在模型中通過獨立調節(jié)心肌細胞或心臟成纖維細胞影響重塑結果。這種迷你版本的人源心肌損傷修復模型可為缺血性心臟病治療靶點的批量篩選與評價提供有力工具。（圖5）

圖5. “迷你” hEHT 損傷修復模型的建立

5、不同信號調節(jié)劑對“迷你” hEHT 重塑結果進行多維度評估
接下來，通過分析在第 6 天以心肌細胞（CM）和心臟成纖維細胞（CF）標記物標記的“迷你” hEHT 的 3D 圖像，評估重塑區(qū)域內 CM 體積占比、CM 偏心程度及 CF 應力纖維長度，以反應不同信號調節(jié)劑對迷你 hEHT重塑結果的影響。最終篩選得到 Y27632、CHIR99021 和 SB431542 在心肌再生和抗纖維化方面比其他治療具有更大的益處。（圖6 ）

圖6. 對“迷你” hEHT 損傷修復模型的治療效果評估

6、用于評估重塑區(qū)域功能恢復的綜合評分系統(tǒng)
為了系統(tǒng)性評估 Y27632/CHIR99021/TGFβ 對 hEHT 異常電生理功能的修補作用，開發(fā)包含 9 種鈣活動特征指標的評分體系，鑒定出Y27632/CHIR99021/TGFβ 依據(jù)重塑進程的階段性組合干預，相較于單因素處理能更好的促進瘢痕區(qū)域內的異常鈣活動恢復到正常水平。這種階段性組合干預的優(yōu)越性可能是 Y27632 早期抗凋亡、CHIR99021 促心肌細胞增殖以及 SB431542 晚期抗纖維化的復合作用引起的。

圖7. hEHT 修復模型中對異常鈣活動恢復的治療效果的綜合評估

7、心肌梗死小鼠對 Y27632、CHIR99021 和 SB431542 的聯(lián)合治療表現(xiàn)出心臟功能恢復
新生小鼠心臟有強大再生能力但隨年齡下降。對新生小鼠進行透壁低溫損傷，驗證 Y27632、CHIR99021 和 SB431542 單因素及組合治療效果，聯(lián)合治療可保留心室結構并減少纖維化區(qū)域。在成年小鼠心肌梗死模型中，聯(lián)合治療在治療后 21 天顯著增強心臟功能、減少纖維化區(qū)域，CHIR99021 階段性單因素治療可減少瘢痕形成但不能恢復功能。階段性干預促進功能恢復，驗證這些藥物的潛在價值，聯(lián)合治療對成年梗死小鼠電生理功能障礙效果最佳。（圖8）

圖8. 在成年小鼠心肌梗死模型中，聯(lián)合治療減少纖維化區(qū)域并增強心臟功能

梗死大鼠重塑區(qū)和未損傷區(qū)鈣活性的表征

因此，本文發(fā)現(xiàn)了一種新型的 hEHT 損傷修復模型，講述了心肌病理性重塑進程與信號調控，并依據(jù)病程發(fā)展的階段，進行階段性信號調控策略，為篩選治療 IHD 潛在抗纖維化和心臟再生藥物靶點提供有價值的參考。