免疫PCR實驗步驟過程詳述
免疫PCR（Immuno-PCR，iPCR）結(jié)合了 ELISA 的特異性和 PCR 的信號放大功能，在抗體上偶聯(lián)了核苷酸，這種偶聯(lián)物可以充當(dāng)免疫反應(yīng)和 DNA 擴(kuò)增之間的橋梁，使ELISA法靈敏度放大1000倍。
免疫PCR原理：
夾心免疫 PCR是最常見的 iPCR形式，將捕獲抗體固定在微量滴定板表面，用于結(jié)合目標(biāo)分析物。隨后，捕獲抗體與寡核苷酸偶聯(lián)的二抗結(jié)合。通過實時 PCR 擴(kuò)增并檢測 DNA。
一、主要程序：
（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；
（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（4） PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。
二、實驗步驟：
（1）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt,用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即為生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
試劑：
包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗滌液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀釋液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1mg/ml）。
三、操作步驟：
（1） 包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。
（2） 封閉：
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min,洗板數(shù)次。
（3） 抗原抗體反應(yīng)：
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。
（4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)：
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min,再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
（5） PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
免疫PCR原理：
夾心免疫 PCR是最常見的 iPCR形式，將捕獲抗體固定在微量滴定板表面，用于結(jié)合目標(biāo)分析物。隨后，捕獲抗體與寡核苷酸偶聯(lián)的二抗結(jié)合。通過實時 PCR 擴(kuò)增并檢測 DNA。
一、主要程序：
（1） 抗原+生物素化抗體→抗原-生物素化抗體復(fù)合物；
（2） 加親合素→抗原-生物素化抗體-親合素復(fù)合物；
（3） 加生物素化DNA→抗原-生物素化抗體-親合素-生物素化DNA；
（4） PCR擴(kuò)增生物素化DNA部分。
二、實驗步驟：
（1）制備生物素化DNA
將噬粒 BLuescript skt,用生物素標(biāo)記的M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增制備出含T3和T7引物序列的280bp DNa段，即為生物素化DNA。
（2）免疫PCR模式
試劑：
包被緩沖液：20mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150mmol/L NaCl和0.02%NaN3；
洗滌液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/LNaCl0.1mmol/L EDTA和0.1%Tween20；
稀釋液：20mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150mmol/L NaCl0.45%脫脂奶及變性鮭魚精DNA （0.1mg/ml）。
三、操作步驟：
（1） 包被
用包被緩沖液稀釋抗原（BSA），加入微滴板中（45μl孔），4℃（約15h），用洗滌液洗板3次×5min。
（2） 封閉：
每孔加200μl含4.5%脫脂奶及變性鮭魚精子DNA（1mg/ml）、0.1mmol/L EDTA的20mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150mmol/L NaCl緩沖液，37℃溫育80min,洗板數(shù)次。
（3） 抗原抗體反應(yīng)：
用釋釋液1:8000稀釋單克隆抗BSA抗體，每孔加50μl，室溫（22℃）下45min，洗板孔15次×10min，去除未結(jié)合的抗體分子。
（4） 鏈親合一蛋白A結(jié)合反應(yīng)：
每孔加入50μl用稀釋液稀釋的已與生物素-pUC19結(jié)合的鏈親合素-蛋白A嵌合體，室溫（22℃）50min，使得嵌合體-pUC19結(jié)合于固相的抗原抗體復(fù)合物上，然后洗板15次×10min,再用無NaN3的TBS洗3次，然后即可將微滴板用于后面的PCR反應(yīng)。
（5） PCR
實驗條件 50mmol/L KCI、10mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5mmol/LMgCl2、明膠（10μg/ml）、0.8mmol/LdNTPs（每種0.2mM）、2μM引物（每一引物1μM）和TaqDNA多聚酶（50U/ml）。
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