LC-MS應(yīng)用：阿昔洛韋霜5%（Zovirax, US）的體外滲透研究（IVPT）

一、摘要

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）建議在進(jìn)行阿昔洛韋霜的體外滲透測(cè)試（IVPT）時(shí)，在每次取樣間隔進(jìn)行完荃介質(zhì)更換，原因是存在“明顯的負(fù)向通量”。完荃更換需要大量的分析干預(yù)或復(fù)雜的自動(dòng)化操作，并且通常需要使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）來檢測(cè)如此低的濃度，所有這些都可能既昂貴又復(fù)雜。選擇使用等分取樣法進(jìn)行IVPT可能更簡(jiǎn)單，并允許使用成本較低的液相色譜（LC）設(shè)備，因?yàn)樵谘芯科陂g，分析物的濃度足夠高，可以使用高效液相色譜紫外檢測(cè)（HPLC UV detection）進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)在整個(gè)延長(zhǎng)的運(yùn)行過程中保持溶解度漏斗條件。這項(xiàng)研究顯示，在使用現(xiàn)代擴(kuò)散裝置進(jìn)行阿昔洛韋霜的IVPT時(shí)，等分取樣是合適的，這可能是由于擴(kuò)散池設(shè)計(jì)的創(chuàng)新確保了接收室和臂干的均一性，消除了“明顯的負(fù)向通量”，這是業(yè)界一直無法解釋的現(xiàn)象。盡管本研究使用的是阿昔洛韋作為測(cè)試成分，但部分介質(zhì)更換也可以用于其他化合物，如類固醇或抗真菌化合物。

二、引言

在美國(guó)，許多藥品的通用版本廣泛可用，這對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。¹ 通用藥品的經(jīng)濟(jì)可負(fù)擔(dān)性直接源于開發(fā)大多數(shù)通用藥品時(shí)采用的高效科學(xué)和監(jiān)管方法，這通常依賴于比較藥代動(dòng)力學(xué)（PK）研究來評(píng)估藥物在作用部位或附近的釋放速率和程度是否與參考上市藥品（RLD）一致。²

這種方法用于評(píng)估比較生物利用度（BA）是最準(zhǔn)確、最敏感且蕞具可重復(fù)性的方法之一，以證明通用藥品的生物等效性（BE）。對(duì)于旨在輸送到全身循環(huán)的藥物，如許多口服劑型一樣，這種方法涉及在給藥后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血液樣本，并測(cè)量血漿或血清中的藥物（或相關(guān)分析物）濃度，這是一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的過程。然而，對(duì)于局部作用藥物，如局部皮膚用藥產(chǎn)品，評(píng)估藥物在皮膚作用部位或附近的濃度更具挑戰(zhàn)性。因此，通用版局部用藥的開發(fā)通常依賴于比較臨床終點(diǎn)BE研究，這些研究不如PK研究準(zhǔn)確、敏感和可重復(fù)，且成本更高、耗時(shí)更長(zhǎng)。大多數(shù)通用局部用藥產(chǎn)品被歸入昂貴且低效的開發(fā)路徑，因此成為通用藥品開發(fā)商進(jìn)入市場(chǎng)的障礙，并對(duì)它們的可獲得性和經(jīng)濟(jì)性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

局部皮膚用藥產(chǎn)品中顯著的例外是含有糖皮質(zhì)激素的藥物，美國(guó)食品和藥物管理局推薦使用更高效的體內(nèi)藥效學(xué)（PD）血管收縮試驗(yàn)來證明其BE。因此，盡管這些含糖皮質(zhì)激素的乳膏、軟膏和其他局部劑型只占局部皮膚用藥產(chǎn)品的一小部分，但這些RLD產(chǎn)品有多個(gè)通用版本可供選擇。本研究的假設(shè)是，如果可以開發(fā)出同樣高效的皮膚PK、BE方法，這些方法可以促進(jìn)更多經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的通用局部皮膚用藥產(chǎn)品的可用性。

近幾十年來，已經(jīng)考慮了現(xiàn)有體外和體內(nèi)皮膚PK方法的可行性，每種方法都有不同的優(yōu)勢(shì)和局限性。在這些方法中，最有前景的是體外滲透試驗(yàn)（IVPT）方法，該方法已顯示出與體內(nèi)結(jié)果的良好相關(guān)性。值得注意的是，IVPT研究特別顯示出與體內(nèi)評(píng)估BE的相關(guān)性，并具有預(yù)測(cè)性。

本工作的目標(biāo)是評(píng)估一種用于阿昔洛韋霜BA的IVPT方法，完荃更換接收液³與部分更換接收液相比。

該研究由一位經(jīng)驗(yàn)豐富的教授監(jiān)督，在孟買Chembur East的Vivekanand教育協(xié)會(huì)藥學(xué)院（VES Pharmacy）由一名訓(xùn)練有素的研究員進(jìn)行。Hanson的Phoenix DB-6系統(tǒng)已安裝，并在研究開始前由位于印度孟買的Teledyne Hanson服務(wù)工程師進(jìn)行了IQ、OQ、PQ驗(yàn)證。

三、材料和方法

材料：本研究使用了以下試劑和材料。

以下儀器在本研究中使用：

皮膚：皮膚樣本取自印度馬哈拉施特拉邦Navi Mumbai的國(guó)家燒傷中心。

皮膚準(zhǔn)備：皮膚采集程序：

第一階段：使用取皮刀獲取皮膚，并儲(chǔ)存在含有抗生素的50%甘油中。

第二階段：將每條皮膚從50%甘油轉(zhuǎn)移到含有抗生素的85%甘油中。

第三階段：第二階段后（21天），皮膚在4-8°C下儲(chǔ)存在85%甘油中。

分析當(dāng)天，皮膚被解凍、清洗并用PBS溶液（接收介質(zhì)）沖洗，根據(jù)所需數(shù)量使用模具和沖孔機(jī)（Neiko 0261 14A重型工具01594L，Duty空心孔沖孔套裝）切成25毫米的圓形片段；每片皮膚都在放大鏡下進(jìn)行視覺檢查，以確認(rèn)是否有任何損傷或不適合使用的情況，作為完整性確認(rèn)的一部分。此外，使用校準(zhǔn)的微螺旋測(cè)微器測(cè)量每個(gè)皮膚部分的厚度。厚度測(cè)量完成后，將皮膚安裝在12毫升Franz擴(kuò)散池的供體隔室中。

體外滲透試驗(yàn)

使用Teledyne Hanson擴(kuò)散系統(tǒng)（手動(dòng)系統(tǒng)，Phoenix DB-6）進(jìn)行IVPT實(shí)驗(yàn)。使用了12毫升的擴(kuò)散池，其滲透面積為1.0平方厘米。接收液是含有0.1%疊氮鈉的PBS緩沖液（pH 7.4），攪拌速度為400轉(zhuǎn)/分鐘。皮膚樣本安裝在擴(kuò)散池中，表皮面向供體隔室（n = 3）。使用正位移移液器將單劑量26.55毫克/平方厘米的阿昔洛韋霜（每平方厘米1.37毫克阿昔洛韋）涂在皮膚表面。在皮膚表面涂抹霜?jiǎng)┖�，用正位移移液器的暴露聚四氟乙烯尖立耑輕輕將制劑涂抹在整個(gè)滲透區(qū)域。劑量應(yīng)用區(qū)域在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持開放，不進(jìn)行任何封閉。IVPT實(shí)驗(yàn)持續(xù)72小時(shí)，連續(xù)采樣時(shí)間點(diǎn)。選擇兩個(gè)參數(shù)，Jmax和與阿昔洛韋滲透曲線的AUC相對(duì)應(yīng)的累計(jì)總滲透量作為兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。所得的接收液樣品通過高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析。

四、HPLC樣品分析

IVPT樣品在由Jasco 4000系列組成的HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行分析，配備PDA檢測(cè)器和ChromNav數(shù)據(jù)采集軟件，版本1。使用部分驗(yàn)證的HPLC方法對(duì)IVPT樣品進(jìn)行定量測(cè)定。采用BakerBond 5μC18（250 x 4.6 mm）柱來洗脫阿昔洛韋。流動(dòng)相為甲醇與50 mM磷酸鈉溶液按5:95（體積比）混合，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0。流速為1.0 mL/分鐘。阿昔洛韋峰在254 nm處檢測(cè)。IVPT樣品的進(jìn)樣量為100 µL。IVPT擴(kuò)散樣品的定量下限（LLOQ）為0.025 μg/mL。

五、體外滲透試驗(yàn)（IVPT）結(jié)果

當(dāng)使用從兩名供體獲得的皮膚進(jìn)行IVPT測(cè)試實(shí)驗(yàn)，篩選和比較阿昔洛韋霜時(shí)，通過Zovirax霜中阿昔洛韋的皮膚滲透量采用兩種不同的取樣技術(shù)進(jìn)行測(cè)量：（i）部分樣品取出和（ii）完荃樣品取出。

圖1和圖2展示了每個(gè)時(shí)間間隔使用部分取樣的IVPT數(shù)據(jù)。觀察到供體內(nèi)部變異性，但供體內(nèi)變異性僅為完荃替換對(duì)照的三分之一（%RSD < 5.0）。兩個(gè)供體的總體結(jié)果表明，阿昔洛韋霜的AUC（0-72小時(shí)）分別為102 µg/cm²和64.4 µg/cm²。阿昔洛韋霜的Jmax分別為2.8 µg/cm²/h和3.9 µg/cm²/h。Tmax為兩個(gè)供體均為24小時(shí)。在完荃替換中可能會(huì)存在高變異性，因?yàn)槊看稳�樣點(diǎn)的藥物濃度非常低，這導(dǎo)致許多分析接近定量下限（LLOD）。然而，部分替換穩(wěn)定允許接收液中的活性藥物濃度增加，使用HPLC系統(tǒng)作為分析技術(shù)提供了更好的結(jié)果，因?yàn)榉治鰞x器在檢測(cè)范圍內(nèi)運(yùn)行，使得結(jié)果更加一致。

圖1：阿昔洛韋的累積滲透（部分替換）

圖2：阿昔洛韋的滲透曲線（部分替換）

圖3和圖4展示了每個(gè)時(shí)間間隔使用完荃介質(zhì)替換取樣的IVPT數(shù)據(jù)。觀察到供體內(nèi)變異性，但供體內(nèi)變異性非常低（% RSD < 15.0）。兩個(gè)供體的總體結(jié)果表明，阿昔洛韋霜的AUC（0-72小時(shí)）分別為10.9 µg/cm²和4.8 µg/cm²。阿昔洛韋霜的Jmax分別為0.4 µg/cm²/h和0.12 µg/cm²/h。Tmax為兩個(gè)供體均為72小時(shí)。

圖3：阿昔洛韋的累積滲透（完荃替換）

圖4：阿昔洛韋的滲透曲線（完荃替換）

結(jié)果 - 總結(jié)表1

六、結(jié)論

這些結(jié)果表明，IVPT研究可以使用兩種取樣程序進(jìn)行。從數(shù)據(jù)中可以看出，使用部分體積替換產(chǎn)生的變異性小于完荃替換。完荃替換方法觀察到的滯后時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，而部分替換研究的滯后時(shí)間僅為4小時(shí)。這24小時(shí)的滯后時(shí)間是由于完荃替換導(dǎo)致的，因此阿昔洛韋的濃度低于HPLC分析的定量下限（LLOQ）。在部分替換研究中，觀察到的Jmax值較高，因?yàn)樵谡麄�(gè)研究期間活性成分的濃度逐漸增加，而在完荃替換的情況下，觀察到的Jmax值非常低。因此，建議在使用完荃替換取樣程序時(shí)使用LC-MS進(jìn)行定量測(cè)定。LC-MS是一種昂貴且需要特殊環(huán)境條件進(jìn)行日常維護(hù)的儀器，任何組織都難以承擔(dān)其使用和維護(hù)成本。因此，我們建議在進(jìn)行IVPT研究時(shí)，使用部分替換方法，即在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)不進(jìn)行接收介質(zhì)的完荃替換，而是采用等分試樣取樣程序，特別是當(dāng)使用HPLC分析時(shí)。

七、引用

1. https://doi.org/10.1007/s43441-019-00104-3: In Vitro Skin Permeation Methodology for over-the counter Topical Dermatologic Products

2. https://doi.org/10.1007/s11095-020-02821-z: Cutaneous Pharmacokinetics of Acyclovir Cream 5% Products:Evaluating Bioequivalence with an In Vitro Permeation Test and an Adaptation of Scaled Average Bioequivalence

3.https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/psg/Acyclovir_topical%20cream_RLD%2021478_RV12-16.pdf:Draft Guidance on Acyclovir, Recommended Dec 2014,Revised Dec 2016