活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用展望

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見(jiàn)光體內(nèi)成像通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)等方面。

一、 技術(shù)原理
1. 標(biāo)記原理
哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對(duì)于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。目前, 常用的細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好, 市場(chǎng)上已有銷售。 將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無(wú)法觀察到的，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。

2. 光學(xué)原理
光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個(gè)細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系�？梢�(jiàn)光體內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。

3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。典型的成像過(guò)程是：小鼠經(jīng)過(guò)麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開(kāi)啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈, 在沒(méi)有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過(guò)程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強(qiáng)大，可以加快實(shí)驗(yàn)速度，方便大批量的實(shí)驗(yàn)。

4．熒光成像功能
熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇。
雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)， 進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。

二、 技術(shù)應(yīng)用
通過(guò)活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測(cè)到癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及中藥（單體或復(fù)方）治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物疾病模型，觀測(cè)治療炎癥等的中藥治療效果。具體應(yīng)用如下：

1.中草藥抗腫瘤療效觀察
應(yīng)用活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)可以直接快速地測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估�；铙w生物發(fā)光成像能夠無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。生物發(fā)光成像技術(shù)提高了檢測(cè)的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測(cè)到（可以檢測(cè)到體內(nèi)102個(gè)細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移）。
為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究�？捎糜谟^察中藥誘導(dǎo)特定基因表達(dá)或關(guān)閉。
研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等�？商峁┌谢�因在體內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來(lái)評(píng)估候選中藥和其它化合物的毒性。為中藥在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。

中藥現(xiàn)代研究存在的問(wèn)題：
（1）單體與復(fù)方：現(xiàn)在大家研究中藥動(dòng)輒就分離單體，鑒定結(jié)構(gòu)，然后用一些需要樣品量很少的體外模型。然而通過(guò)天然藥物化學(xué)手段分離出來(lái)的成分（尤其是單體）含量極少，成本很高，往往不能滿足藥效評(píng)價(jià)的藥量，簡(jiǎn)單的體外篩選由于藥物本身的理化性質(zhì)、體內(nèi)代謝的不同與體內(nèi)用藥差別很大，也有點(diǎn)偏離里中醫(yī)藥的整體思想，未能充分重視中醫(yī)藥的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)。傳統(tǒng)中藥很少單用，多為組方用藥，中藥的療效主要是方劑的藥效。中藥(尤其是復(fù)方)的整體性作用機(jī)制和療效在系統(tǒng)代謝組學(xué)的研究方法下將可能得到充分的展示和“挖掘”。尋找疾病的多靶點(diǎn)治療方式：以"靶點(diǎn)"為基礎(chǔ)的復(fù)方研究應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)。復(fù)方中藥運(yùn)用中醫(yī)陰陽(yáng)平衡理論、藏象學(xué)說(shuō)和扶正祛邪等理論，合理配伍，從整體上治療許多疑難疾病。

（2）吸收現(xiàn)代科學(xué)的精華，用現(xiàn)代科學(xué)語(yǔ)言闡釋中醫(yī)藥理論與療效的本質(zhì)：傳統(tǒng)中藥的作用機(jī)理都是根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的精氣神、五行等理論來(lái)解釋的，在許多方面都是很有道理的，但是中藥要現(xiàn)代化，要面向世界的話，就得在某些地方與國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生的標(biāo)準(zhǔn)接軌。所以中藥現(xiàn)代化應(yīng)重視中藥化學(xué)組學(xué)和中藥基因組學(xué)，將生物芯片、活體成像等為核心的技術(shù)引入到現(xiàn)代中藥研究中去。
正如前面所說(shuō)，由于中藥的成分非常的復(fù)雜，各種成分的藥理和相互作用不明確，這樣很難讓外國(guó)人接受，因?yàn)樗麄兪⑿械氖呛铣伤�，是一種有效成分，或者僅僅是幾種成分，做過(guò)西藥液相或者處方篩選的戰(zhàn)友都知道西藥處方中無(wú)非就是主藥、幾種輔料混合在一起，使得主藥既能夠達(dá)到藥理作用，剛剛好在治療窗之內(nèi)，又要保證藥物的溶出（主要針對(duì)固體制劑，如片劑、膠囊等；液體制劑除外）。

（3）中藥臨床前研究：建立中藥藥動(dòng)學(xué)，擁有自己的一套能夠讓人家心服口服的標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)務(wù)之急，這對(duì)于中藥的現(xiàn)代化也許是一個(gè)里程碑。
加大給藥系統(tǒng)的研究。圍繞提高藥物的生物利用度、平穩(wěn)的血藥濃度和優(yōu)良的藥物代謝參數(shù)、給藥的靶向性三個(gè)方面去努力，最終達(dá)到以最小劑量的給藥達(dá)到治療效果，以回避可能產(chǎn)生的毒副作用。

應(yīng)用舉例：喜樹(shù)堿治療腫瘤的療效觀察
Preclinical Efficacy of the Camptothecin-Polymer Conjugate IT-101inMultiple Cancer Models
Clin Cancer Res 12(5),1606-1614,March 1, 2006

Fig. 5. Antitumor effect of irinotecan at100 mg/kg (top) and IT-101at12.5 mg/kg CPTequivalents (bottom) in a disseminatedTC71-luc tumormodel (Ewing’s sarcoma) in nonobese diabetic/severe-combined immunodeficient mice.Tumor burden as a function of time (in days) was monitored using a Xenogen imaging system. Arrows, treatment n days 0, 7, and 14. Color bar, lighti ntensity emitted in photons per second.

應(yīng)用活體成像技術(shù)進(jìn)行中藥的療效觀察的優(yōu)勢(shì)在于：

Ø 從動(dòng)物水平進(jìn)行了療效觀察，避免由于體內(nèi)微環(huán)境不同而導(dǎo)致的療效差別。這也符合中醫(yī)整體觀念的特點(diǎn)，與其不某而合。
Ø 適用于中藥復(fù)方的研究，通過(guò)結(jié)果來(lái)判斷藥物的療效，給予充分的證據(jù)。
Ø 中藥藥物動(dòng)力學(xué)模型的探索。
Ø 中藥配伍的優(yōu)化。通過(guò)給予不同的配伍，利用活體成像的優(yōu)勢(shì)，方便的觀察不同配伍的復(fù)方的療效差別。
Ø 中藥劑量、服藥時(shí)間、劑型的優(yōu)化

2. 中醫(yī)機(jī)理研究：標(biāo)記某基因，觀察與某些中醫(yī)證侯的相關(guān)性表達(dá)，從基因水平研究中醫(yī)“證”的本質(zhì)。

藏象學(xué)說(shuō)是中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論的核心，辯證論治是中醫(yī)學(xué)治療疾病的核心思想。圍繞著中醫(yī)“證”本質(zhì)，近年來(lái)從現(xiàn)代科學(xué)的角度，用分子生物學(xué)的相關(guān)手段，從分子水平進(jìn)行了大量的研究。中醫(yī)的“證”是辨證論治的起點(diǎn)和核心，辨證綜合了產(chǎn)生病變的各方面(包括當(dāng)時(shí)的氣候和環(huán)境情況)因素和條件，并結(jié)合個(gè)體體質(zhì)、疾病發(fā)生的不同階段和表現(xiàn)，判定為不同的證，從而采用不同治法，通過(guò)合理配伍、適時(shí)調(diào)整藥量而達(dá)到治療效果。由此，可以認(rèn)為“證”的研究能與處于科學(xué)前沿、綜合程度很強(qiáng)的系統(tǒng)生物學(xué)方法相結(jié)合，同時(shí)也是生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的結(jié)合。這將把“證”的研究再次推向科學(xué)發(fā)展的前沿，成為中醫(yī)現(xiàn)代化最重要的研究方向之一。最近興起的系統(tǒng)生物學(xué)，將把系統(tǒng)論的精華、中醫(yī)學(xué)辯證論治的研究有機(jī)的結(jié)合，互相取長(zhǎng)補(bǔ)短，相互滲透，充分運(yùn)用中醫(yī)學(xué)整體觀念的哲學(xué)智慧，把生命科學(xué)的研究推向一個(gè)新的高度。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠，可以方便的觀察中醫(yī)各種證侯對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響，觀察藥物對(duì)于相應(yīng)證侯的治療效果。如果從基因表達(dá)水平證明證的本質(zhì)，找出腎陰虛等的特異性基因，從基因水平闡釋不同體質(zhì)個(gè)體的差異，那將極大地促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的步伐。