酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

酵母雙雜交技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用

作為后基因組時代出現(xiàn)的新興研究領(lǐng)域之一, 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)正受到越來越多的關(guān)注。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目標(biāo)是對機體或細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析。 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究不局限任何特定的方法。 高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)如二維凝膠電泳和高效液相層析, 經(jīng)典的蛋白質(zhì)鑒定方法如氨基酸序列分析等, 現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù), 基因組學(xué)研究的各種手段, 現(xiàn)代計算機信息學(xué)和計算機網(wǎng)絡(luò)通訊技術(shù)等等, 任何可用于蛋白質(zhì)研究的技術(shù)手段, 蛋白質(zhì)組學(xué)都可能會采用。 它體現(xiàn)的是一個開放的思維和研究方式。
　　蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用是細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)和特征。 這種千變?nèi)f化的相互作用以及由此形成的紛繁復(fù)雜的蛋白質(zhì)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)同樣也是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容, 相應(yīng)的工作也已經(jīng)開展。
　　酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)自建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強有力的方法之一。 該方法在不斷完善, 如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用, 而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì), 在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識上發(fā)揮了重要的作用。 實驗表明雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)上的應(yīng)用是成功的。 本文將就雙雜交技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展及其在蛋白質(zhì)組研究方面的初步應(yīng)用作一介紹。

1　蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生背景
　　基因組研究自從開展以來已經(jīng)取得了舉世矚目的成就。 在過去幾年中, 已經(jīng)陸續(xù)完成了包括大腸桿菌、釀酒酵母等十多種結(jié)構(gòu)比較簡單的生物的基因組DNA的全序列分析［1］。 線蟲(C.elegans)的基因組DNA測序工作已基本完成［2］。 規(guī)模更為龐大的人類基因組計劃預(yù)期在下一世紀(jì)的前幾年(2003～2005年)也將完成全部基因組DNA的序列分析。 這些進(jìn)展是非常令人振奮的。 但是也隨之產(chǎn)生了新問題。 大量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個問題。 不僅如此, 在細(xì)胞合成蛋白質(zhì)之后, 這些蛋白質(zhì)往往還要經(jīng)歷翻譯后的加工修飾。 也就是說, 一個基因?qū)��?yīng)的不是一種蛋白質(zhì)而可能是幾種甚至是數(shù)十種。 包容了數(shù)千甚至數(shù)萬種蛋白質(zhì)的細(xì)胞是如何運轉(zhuǎn)的？或者說這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)是怎樣工作、如何相互作用、相互協(xié)調(diào)的？這些問題遠(yuǎn)不是基因組研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)應(yīng)運而生。
　　蛋白質(zhì)組(proteome)一詞是馬克.威爾金斯(Marc Wilkins)最先提出來的［3］, 最早見諸于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上［4］, 它是指一個有機體的全部蛋白質(zhì)組成及其活動方式。 蛋白質(zhì)組研究雖然尚處于初始階段, 但已經(jīng)取得了一些重要進(jìn)展。 當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)的主要內(nèi)容是, 在建立和發(fā)展蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)方法的同時, 進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。 對蛋白質(zhì)組的分析工作大致有兩個方面。 一方面, 通過二維凝膠電泳得到正常生理條件下的機體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的圖譜, 相關(guān)數(shù)據(jù)將作為待檢測機體、組織或細(xì)胞的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫。 一系列這樣的二維參考圖譜和數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立并且可通過聯(lián)網(wǎng)檢索。 二維參考圖譜建立的意義在于為進(jìn)一步的分析工作提供基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)組分析的另一方面, 是比較分析在變化了的生理條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化。 如蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化, 翻譯后修飾的變化, 或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞水平上的定位的改變等。 關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)的介紹可參閱文獻(xiàn)［5,6］。
　　細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)不是雜亂無章的混合物, 蛋白質(zhì)間的相互作用、相互協(xié)調(diào)是細(xì)胞進(jìn)行一切代謝活動的基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)間的相互作用及作用方式同樣也是蛋白質(zhì)組研究所面臨的問題。 研究蛋白質(zhì)間的相互作用有多種方法, 常用的如酵母雙雜交系統(tǒng)、親和層析、免疫沉淀、蛋白質(zhì)交聯(lián)等。 其中, 酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。

2　酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與發(fā)展
　　雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。 細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 80年代的工作表明, 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, 簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, 簡稱為AD), 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合, 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。 如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點并激活轉(zhuǎn)錄［7］。
　　Fields等人的工作標(biāo)志雙雜交系統(tǒng)的正式建立［8］。 他們以與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型, 將前者與Gal4的DB結(jié)構(gòu)域融合, 另外一個與Gal4的AD結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。 由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或靶蛋白(prey or target protein)。 如果在Snf1和Snf2之間存在相互作用, 那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子, 從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。 這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因(reporter gene)。 通過對報道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測, 反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。 在此Fields等人采用編碼β-半乳糖苷酶的LacZ作為報道基因, 并且在該基因的上游調(diào)控區(qū)引入受Gal4蛋白調(diào)控的GAL1序列。 這個改造過的LacZ基因被整合到酵母染色體URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的負(fù)調(diào)控因子)被缺失, 從而排除了細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響。 已經(jīng)知道在Snf1和Snf2之間存在相互作用。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和Snf2融合表達(dá)載體的酵母細(xì)胞才有β-半乳糖苷酶活性, 單獨轉(zhuǎn)化其中任何一個載體都不能檢測出β-半乳糖苷酶活性。
　　目前發(fā)展起來的各種雙雜交系統(tǒng)大多是以Fields等人建立的系統(tǒng)為基礎(chǔ)的。 這些新系統(tǒng)主要對報道基因、“誘餌”表達(dá)載體以及“獵物”表達(dá)載體等做了一些改進(jìn)。 其中一個重要改進(jìn)是引入額外的報道基因, 如廣泛采用的HIS3基因。 經(jīng)過改造帶有HIS3報道基因的酵母細(xì)胞, 只有當(dāng)HIS3被啟動表達(dá)才能在缺乏組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上生長。 HIS3報道基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是由“誘餌”和“獵物”的相互作用所啟動的。 大多數(shù)雙雜交系統(tǒng)往往同時使用兩個甚至三個報道基因, 其中之一是LacZ。 這些改造后的基因在啟動子區(qū)有相同的轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點, 因此可以被相同的轉(zhuǎn)錄激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。 通過這種雙重或多重選擇既提高了檢測靈敏度又減少了假陽性現(xiàn)象。 其他還有針對“誘餌”或“獵物”表達(dá)載體等所作的改進(jìn), 這里不一一詳述。
　　在雙雜交鑒定過程中要經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)化, 這個工作量是相當(dāng)大的, 特別是尋找新的作用蛋白質(zhì)的時候尤其如此。 而且, 酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率比細(xì)菌要低約4個數(shù)量級。 因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術(shù)的瓶頸。 Bendixen等人通過酵母接合型的引用, 避免了兩次轉(zhuǎn)化操作, 同時又提高了雙雜交的效率［9］。 在酵母的有性生殖過程中涉及到兩種配合類型： a接合型和α接合型, 這兩種單倍體之間接合(mating)能形成二倍體, 但a接合型細(xì)胞之間或α接合型細(xì)胞之間不能接合形成二倍體。 根據(jù)酵母有性生殖的這一特點, 他們將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化α接合型酵母細(xì)胞, “誘餌”表達(dá)載體轉(zhuǎn)化a接合型細(xì)胞。 然后分別鋪篩選平板使細(xì)胞長成菌苔(lawn), 再將兩種菌苔復(fù)印到同一個三重篩選平板上, 原則上只有誘餌和靶蛋白發(fā)生了相互作用的二倍體細(xì)胞才能在此平板上生長。 單倍體細(xì)胞或雖然是二倍體細(xì)胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰。 長出來的克隆進(jìn)一步通過β-半乳糖苷酶活力進(jìn)行鑒定。 這項改進(jìn)不僅簡化了實驗操作, 而且也提高了雙雜交的篩選效率。
　　在研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能特點、作用方式過程中, 有時還要通過突變、加抑制劑等手段破壞蛋白質(zhì)間的相互作用。 針對實際工作中的這種需要, Vidal等人發(fā)展了所謂的逆雙雜交系統(tǒng)(reverse two-hybrid system)［10,11］。 這項技術(shù)的關(guān)鍵是報道基因URA3的引入。 URA3基因在這里起到了反選擇的作用, 它編碼的酶是尿嘧啶合成的關(guān)鍵酶。 該酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)轉(zhuǎn)化成對細(xì)胞有毒的物質(zhì)。 Vidal等人通過改造在URA3基因的啟動子內(nèi)引入Gal4的結(jié)合位點。 這個改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的選擇性培養(yǎng)基上只有當(dāng)“誘餌”和“獵物”相互作用激活URA3基因的表達(dá)才能生長。 在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上“誘餌”和“獵物”的相互作用則抑制細(xì)胞的生長。 然而如果目的蛋白, 即與DB或AD融合的蛋白質(zhì)發(fā)生了突變或者由于外加藥物的干擾不再相互作用, URA3基因不表達(dá), 則細(xì)胞能在含有5-FOA的完全培養(yǎng)基上生長。 通過這種方法，Vidal等人篩選到了轉(zhuǎn)錄因子E2F1的突變物, 這些突變物仍然能結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白RB, 但是喪失了同另外一種稱為DP1蛋白的結(jié)合能力。 結(jié)果得到了體外結(jié)合實驗的驗證。 通過對這些突變蛋白基因的測序, 他們發(fā)現(xiàn)了新的E2F1同DP1結(jié)合的位點。
　　以上介紹的酵母雙雜交系統(tǒng)都是建立在對RNA聚合酶II的激活的基礎(chǔ)上的。 這意味著雙雜交過程是在細(xì)胞核內(nèi)完成的。 然而許多待研究的蛋白質(zhì)是膜蛋白, 它們需定位到膜上之后才能表現(xiàn)正常的生物功能，與其他蛋白質(zhì)起作用。 有些真核細(xì)胞蛋白還要經(jīng)過翻譯后的加工修飾如二硫鍵的形成、糖基化、聚異戊二烯基化等。 這些加工修飾在正常的細(xì)胞核內(nèi)不可能發(fā)生。 有些蛋白質(zhì)本身具有激活轉(zhuǎn)錄的活性, 它們可不經(jīng)過雙雜交相互作用即能激活報道基因的表達(dá)。 因此根據(jù)需要有人又發(fā)展了新的雙雜交系統(tǒng)。 例如, Aronheim等人設(shè)計了一個Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)［12］, 也被作者稱為Sos救活系統(tǒng)(Sos recruitment system)。 人的鳥苷酸交換因子-Sos蛋白是一種胞質(zhì)蛋白, 而酵母的鳥苷酸交換因子-cdc25蛋白定位在內(nèi)膜上, 可將相關(guān)受體信號傳導(dǎo)給Ras蛋白。 由cdc25突變產(chǎn)生的一種溫度敏感突變型細(xì)胞不能在36 ℃條件下生長。 但是, 如果Sos蛋白可以通過某種方式被定位到酵母細(xì)胞內(nèi)膜上, 那么它在這種溫度敏感突變型細(xì)胞中因替代cdc25蛋白的作用, 而使酵母恢復(fù)在36 ℃條件下生長的能力。 在Aronheim等人設(shè)計的系統(tǒng)中, 待研究的兩個蛋白質(zhì)分別與豆蔻酰基化信號片段和Sos蛋白融合, 前一個融合蛋白定位于膜上, 如果兩個待研究蛋白質(zhì)之間存在相互作用, 這將使Sos也定位到膜上, 從而可激活Ras蛋白使酵母在36 ℃下生長。 利用該技術(shù)Aronheim等人找到了c-Jun的兩個新的作用伙伴。
　　此外還有其他類型的雙雜交甚至三雜交系統(tǒng), 本文不再詳述。

3　雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用
　　雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)組研究上的應(yīng)用可以說尚處于嘗試階段, 這方面的文獻(xiàn)報道還很少, 但已顯示其在分析鑒定細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用方面的潛力。 這里以兩家實驗室的工作為例作一介紹。
　　Fromont-Racine等人［13,14］以10種功能已知的與mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白質(zhì)作起始“誘餌”, 從含有約5×106個克隆的釀酒酵母基因組文庫中進(jìn)行第一輪篩選(這些基因組DNA與AD的基因融合構(gòu)成“獵物”表達(dá)載體)。 經(jīng)過對陽性克隆“獵物”DNA的序列分析, 他們把這些DNA分成兩大類共5項(圖1)： 編碼蛋白質(zhì)的DNA和非編碼蛋白質(zhì)的DNA, 前一類分為四項： A1是在序列上彼此有部分重疊的克隆群。 這一項也是首先分析考慮的對象； A2和A3分別是靠近ORF起始密碼子的編碼蛋白質(zhì)N-末端的片段和ORF內(nèi)部的大編碼片段, A4是其他的編碼序列。 這四項優(yōu)先考慮的順序是： A1>A2>A3>A4。 根據(jù)分析把從中得到的4種靶蛋白做成新的“誘餌”進(jìn)行第二輪篩選。 再把從中得到的一種“獵物”做成“誘餌”進(jìn)行第三輪篩選。 如此經(jīng)過三輪共十五次篩選, 他們從中共得到約700個陽性克隆并且對大多數(shù)作了部分測序。 這些篩選到的靶蛋白中, 有9種是已知的mRNA前體剪接因子, 5種是新發(fā)現(xiàn)的剪接因子, 8種是與RNA其他加工過程有關(guān)的因子, 還有45種與其他的功能有關(guān)。 另外有9種是轉(zhuǎn)錄激活因子, 這主要來自假陽性克隆。 他們不僅發(fā)現(xiàn)了已知剪接因子與其他因子的相互作用, 鑒定了一些新的因子, 而且建立了這個剪接途徑與其他代謝途徑的聯(lián)系。
據(jù)此Fromont-Racine等人聲稱, 如果選擇不同的細(xì)胞代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為出發(fā)點, 通過類似的雙雜交實驗最終有可能建立酵母細(xì)胞完整的蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜。 推而廣之, 這項技術(shù)同樣也能用到人類蛋白質(zhì)組研究中。
Fromont-Racine等人能在較短的時間完成如此大量的篩選、分析工作, 一個非常關(guān)鍵的因素是他們采用了上述Bendixen等人建立的通過酵母的有性接合得到雙雜交菌株, 并且對此技術(shù)作了進(jìn)一步的改進(jìn)。 Bendixen等人是通過把兩種接合型細(xì)胞同時復(fù)印到一個平板上使之接合；而Fromont-Racine則是把兩種細(xì)胞直接在濾膜上混合然后鋪到選擇性平板上, 因此避免了煩瑣的復(fù)印操作, 使工作效率進(jìn)一步有所提高［13］。
　　與此類似, Hudson等人也正在進(jìn)行釀酒酵母的蛋白質(zhì)組的研究分析工作［14］。 他們把酵母所有的即約6 000多種蛋白質(zhì)開放讀碼框(ORF)，分別構(gòu)建成與DB和AD基因融合的表達(dá)載體。 兩類載體分別轉(zhuǎn)化不同接合型酵母菌株。 6 000株分別表達(dá)不同的AD-ORF即“獵物”的細(xì)胞在16張384孔微滴定板上培養(yǎng), 再取少許菌液點在只表達(dá)一種BD融合蛋白的細(xì)胞形成的菌苔上使兩種細(xì)胞接合形成二倍體, 然后按照常規(guī)的雙雜交技術(shù)鑒定“誘餌”和AD融合蛋白是否發(fā)生相互作用(圖2)。 整個過程主要是在384孔微滴定板上完成的。 和Fromont-Racine等人的方法相比, 這個方法的優(yōu)點是操作過程可最大程度地自動化, 微滴定板的使用也大大提高了處理量。 這項工作雖已由Frederickson作了介紹, 但目前為止尚未見到它正式發(fā)表。 根據(jù)Frederi-ckson的評論, 這個方法如果成功的話, 那末它很有可能在人類蛋白質(zhì)組研究中得到應(yīng)用。
4　結(jié)束語
　　酵母雙雜交技術(shù)問世不到十年, 但已經(jīng)在蛋白質(zhì)間的相互作用研究、篩選新的蛋白質(zhì)、研究蛋白質(zhì)的功能等諸方面發(fā)揮重要作用。 雙雜交技術(shù)固然有其內(nèi)在的不足之處, 如通過雙雜交觀察到的蛋白質(zhì)的相互作用在真實情況下不一定發(fā)生, 也即所謂的假陽性； 假陰性現(xiàn)象也是雙雜交分析過程中經(jīng)常碰到的問題； 一些對細(xì)胞致命的蛋白質(zhì)也不適宜通過雙雜交系統(tǒng)來分析。 雙雜交只是反映蛋白質(zhì)間能發(fā)生作用的可能性, 這種可能還必須經(jīng)過其他實驗驗證, 尤其要與生理功能研究相結(jié)合, 否則可能會誤入歧途。 雖然如此, 該技術(shù)已經(jīng)成為許多實驗室研究蛋白質(zhì)的相互作用和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的必要手段。 技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新、研究成果的迅速共享為建立有機體的全部蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組組分)的相互作用及其功能關(guān)系圖譜提供了基礎(chǔ)和條件。 我們不奢望通過雙雜交系統(tǒng)能發(fā)現(xiàn)所有真實的蛋白質(zhì)相互作用, 但在沒有更好的方法問世之前, 雙雜交技術(shù)仍是開展這類研究的有力工具。

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