用日新月異的新技術(shù)改造共聚焦顯微鏡

隨著計算機、光學(xué)顯微鏡、大數(shù)值孔徑復(fù)消色差物鏡、高分辨率分析顯示、激光源、激光功率、高敏感度探測器、聲光轉(zhuǎn)換電子控制和各種熒光標記物的發(fā)展，共聚焦顯微鏡向更精、更快、多維和無損傷性分析的方向發(fā)展。技術(shù)進步不斷使共聚焦顯微鏡產(chǎn)生革新，我們重點關(guān)注三大共聚焦顯微鏡制造商奧林巴斯（Olympus）、尼康（Nikon）和卡爾蔡司（Carl Zeiss）在這場技術(shù)革命中的所作所為。

共聚焦顯微鏡是隨著計算機技術(shù)和光電技術(shù)的飛躍發(fā)展，在80年代后期發(fā)展起來的。它是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上增加了激光掃描裝置，利用計算機進行圖像處理，使用紫外光或激光激發(fā)熒光探針，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像，觀察細胞的形態(tài)變化或生理功能的改變。在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，共聚焦顯微鏡可進行活細胞的動態(tài)觀察、細胞無損傷探測、免疫熒光標記和離子熒光探針的觀察和研究，等等。

和普通顯微鏡相比，共聚焦顯微鏡的優(yōu)點是有目共睹的，用它可以掃描3-D圖像，并且有更高分辨率，可以產(chǎn)生質(zhì)量更好的圖像，還可以控制掃描的深度。但是，因為共聚焦顯微鏡的高昂價格，使得很多資金不是十分寬裕的實驗室，對共聚焦顯微鏡只能是望而卻步。隨著技術(shù)的進步，共聚焦顯微鏡的操作更加簡單方便，而且價格也越來越便宜，使越來越多的實驗室能夠買得起，從而為科學(xué)家們提供完善的研究工作站。

技術(shù)進步
使共聚焦系統(tǒng)的操作簡化當(dāng)前的科學(xué)研究問題越來越復(fù)雜，共聚焦系統(tǒng)工藝研究人員一直致力于把系統(tǒng)做得更加容易操作。如今，研究人員不斷的要求新功能和多樣性，這對系統(tǒng)的結(jié)實性和簡便性來說是一個挑戰(zhàn)。一方面，要滿足客戶對產(chǎn)品質(zhì)量和多功能性提出的更新的要求，使得現(xiàn)在的系統(tǒng)做得越來越強大；另一方面，這樣做加深了系統(tǒng)易操作之間的矛盾。

盡管如此，對于共聚焦系統(tǒng)，容易操作仍然被認為是重中之重。儀器使用者感覺到容易操作的是它的用戶界面，用戶界面必須簡單、直觀。例如，在使用尼康軟件的時候，不需要把所有用到的窗口全打開�？丶�被隱藏在標簽后面，這不但使界面更加簡潔，而且有效的防止了用戶的誤操作，這一點對于新用戶來說尤其重要。又如，卡爾蔡司開發(fā)人員認為，在設(shè)計和執(zhí)行共聚焦圖像系統(tǒng)的時候，容易使用應(yīng)該作為它的一個本質(zhì)屬性。

技術(shù)進步改善了
共聚焦系統(tǒng)的性能和性價比共聚焦儀器的性能不斷提高，使用者越來越多，他們都是直接參與科學(xué)研究、具有不同水平的專家，儀器制造商必須能夠滿足這些不同水平專家的需求。用戶都期望性價比不斷提高，隨著技術(shù)的進步，相同性能的系統(tǒng)價格在不斷下降。但是制造商稱，系統(tǒng)的價格會不會降低是另外一個問題。像計算機工業(yè)一樣，價格不會增加，只是價值在不斷增加。因此，我們沒有看到共聚焦顯微鏡的價格大幅度變化，但是其功能卻是新增加了不少。其中最主要的是增加了許多新的成像和分析方法，例如多光譜和多光子成像、熒光相關(guān)分光顯微鏡和全程成像，等等�？紤]到社會發(fā)展使物價不斷攀升，共聚焦系統(tǒng)略微下降的價格確實可以說是價格在不斷降低，而對科研項目資助的不斷提高，使得越來越多的實驗室能夠買得起共聚焦顯微鏡。

共聚焦顯微鏡

在生命科學(xué)研發(fā)中所占的比重共聚焦顯微技術(shù)幾乎已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)中一個標準的研究工具。借助其他各種常規(guī)分析，通過成像方法回答了越來越多的科學(xué)問題�，F(xiàn)在的共聚焦顯微鏡的功能非常多，好像是一個科研工作站，其應(yīng)用也大多在生命科學(xué)研究領(lǐng)域。尼康95％的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)都銷往生物科學(xué)領(lǐng)域。而奧林巴斯顯微鏡在北美的銷售，成像相關(guān)設(shè)備和軟件的市場都集中在生命科學(xué)領(lǐng)域，幾乎所有的共聚焦顯微鏡都供應(yīng)到生命科學(xué)的實驗室和研究中心。應(yīng)用于活細胞的共聚焦顯微鏡對活細胞研究是必要的，并且正在成為活細胞研究的一個常規(guī)工具。如果一個多熒光蛋白質(zhì)標記的細胞有很小的時間間隔的激發(fā)光譜，那么要觀測它們，就需要利用光譜成像來區(qū)分這些不同的激發(fā)光譜，所以尼康引入C1si光譜共聚焦�？�爾蔡司特別關(guān)注熒光顯微技術(shù)，它的顯微對比方法的特異性是其突出的優(yōu)點，并且提出了“卡爾蔡司：熒光科學(xué)”口號。

CCD探頭工藝

對共聚焦系統(tǒng)的影響共聚焦顯微鏡制造商都一致認為，CCD探頭工藝的提高會對未來共聚焦系統(tǒng)產(chǎn)生重大的變革。從過去到現(xiàn)在，CCD的敏感性一直在不斷的提高，而且CCD探頭工藝的進一步提高將會對未來的共聚焦系統(tǒng)產(chǎn)生更重要的影響。CCD照相機敏感性的提高使共聚焦顯微鏡的分辨率接近點掃描共聚焦顯微鏡的水平，可以用來產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的結(jié)構(gòu)圖像。一個顯微鏡同時擁有多個探頭技術(shù)也將會出現(xiàn)。CCD探頭工藝提高已經(jīng)應(yīng)用在卡爾蔡司共聚焦顯微鏡上。卡爾蔡司剛剛發(fā)布了一個新的快速共聚焦系統(tǒng)，即LSM 5 LIVE，它裝配了一種先進的線性探測頭。這個系統(tǒng)是其基于激光的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的一個補充產(chǎn)品。LSM 510 META是基于激光的共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的旗艦產(chǎn)品，它的特征是應(yīng)用了單通道和多通道光電倍增管工藝。它能夠?qū)崿F(xiàn)將多個熒光圖像收集在一起，而不犧牲其清晰度和效率。

旋轉(zhuǎn)圓盤和點掃描技術(shù)的進步

所有共聚焦顯微鏡制造商都在致力于提高其研發(fā)水平和工藝水平，其中旋轉(zhuǎn)圓盤和點掃描型共聚焦系統(tǒng)是重點的研究對象�，F(xiàn)在大約有5個公司基本上都采用相同的材料和工藝生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)圓盤，以前的旋轉(zhuǎn)圓盤正在逐漸被淘汰，因為現(xiàn)在設(shè)計的旋轉(zhuǎn)圓盤只有一個針孔那么大小。尼康掃頻場共聚焦（SFC）是一個場掃描共聚焦，除了具有4個不同的針孔選擇和2個可利用的縫之外，它更像一個旋轉(zhuǎn)圓盤共聚焦顯微鏡。而卡爾蔡司的LSM 5 LIVE是現(xiàn)在掃描技術(shù)的一個重要的補充，這一點從使用過它的科學(xué)家那兒得到的反饋信息可以得到驗證。卡爾蔡司的技術(shù)人員總是能夠做到那些看起來不可能做到的事情，他們在不斷的提高共聚焦裝置的速度和敏感性，一直為提高活細胞成像的質(zhì)量而努力。

共聚焦顯微鏡

在細胞生物學(xué)中的的應(yīng)用奧林巴斯把Fluoview FV1000共聚焦系統(tǒng)應(yīng)用在細胞生物學(xué)展示上，它的敏感性有很大提高，并且能在最小的標本損傷下實現(xiàn)活器官的高速掃描。其SIM掃描儀融合了兩個獨立的高度同步化的激光掃描儀，這種緊湊的設(shè)計使得它們能夠?qū)崿F(xiàn)同步的激光刺激和共聚焦觀測。因此，可以在激光刺激后的瞬間，在沒有任何延時的情況下，捕獲到細胞產(chǎn)生的快速應(yīng)激反應(yīng)。

尼康有一種十分有趣的軟件技術(shù)，被稱作二維實時重疊合法（2DRT）。利用這個軟件，使用者可以在保持畫面每秒幀數(shù)不變的情況下，實時的進行圖像的銳化。穩(wěn)定聚焦輔助技術(shù)是另外一項新出現(xiàn)的技術(shù)，通過它可以在數(shù)天內(nèi)保持用戶設(shè)定的一系列焦距，因此可以在最佳的焦距下對標本進行長時程的觀測。這項技術(shù)擴展了活細胞成像的可利用時間范圍，在以后必將會有日益重要的應(yīng)用。

現(xiàn)在，科學(xué)家的研究范圍不僅僅局限在結(jié)構(gòu)方面，還包括形態(tài)方面的研究。雖然如此，最常使用的仍然是對固定細胞和組織進行2-D和3-D成像。但是不管怎樣，對體外和體內(nèi)狀態(tài)的一系列時間狀態(tài)下測得的圖像數(shù)據(jù)進行成像和定量分析，是以后發(fā)展的一個重要方向。在這樣的研究中，保持細胞的活性非常重要，需要先進的技術(shù)和諸如卡爾蔡司LSM 5 LIVE這樣的共聚焦成像系統(tǒng)的支持。

作者：編譯/蔡倫 中科院計算所