RNA分析的幾個熱點領(lǐng)域及主要技術(shù)路線

DNA，RNA和蛋白質(zhì)是三種重要的生物大分子，是生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)�；�因組DNA中的基因通過轉(zhuǎn)錄為mRNA并進一步翻譯為蛋白質(zhì)，很多種類的蛋白質(zhì)在最終發(fā)揮功能時又經(jīng)歷磷酸化、糖基化、酶原激活等翻譯后修飾。DNA的遺傳信息決定生命的主要性狀，而mRNA在信息傳遞中起很重要的作用。其它兩大類RNA，rRNA和tRNA，同樣在蛋白質(zhì)的生物合成中發(fā)揮不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遺傳信息由DNA傳遞到表現(xiàn)生命性狀的蛋白質(zhì)的過程中舉足輕重。目前國內(nèi)外在mRNA的表達研究上如火如荼，這對于后時代闡明基因的功能至關(guān)重要。

　　但RNA在生命活動中的重要作用遠不止如此：很多種類的病毒直接以RNA為遺傳信息攜帶者，如SARS和AIDS等；而很多其它種類的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子在生命活動中起其它重要作用，如大分子生物加工和基因表達調(diào)控等。下面簡要列舉一些重要的RNA分子及其生物學(xué)意義：
　　snRNA參與 mRNA剪接、 snoRNA參與rRNA成熟加工、 gRNA參與RNA編輯、SRP-RNA參與蛋白質(zhì)的分泌、端粒 RNA參與 DNA端粒合成并影響細胞的壽命、tmRNA參與破損mRNA蛋白質(zhì)合成的終止等。
gRNA（導(dǎo)引RNA）：mRNA編輯
snRNA（核內(nèi)小分子RNA）：mRNA加工（剪接和成熟）
snoRNA（核仁小分子RNA）：rRNA加工（切割和修飾）
RNA P（RNA聚合酶）：tRNA加工
Telomerase RNA：DNA復(fù)制
SRP（信號識別顆粒）-RNA：轉(zhuǎn)運
Lin-4：發(fā)育控制反義RNA（antisence RNA for development control）
rps14：核糖體生物合成反義RNA（antisence RNA for ribosome biogenesis）
dsRNA（雙鏈RNA）：基因沉默（gene silence）
Xist (Xi-specific transcript)&其反義RNA Tsix：X染色體失活

　　尚有很多RNA的功能還未鑒定，如很多scRNA(細胞質(zhì)小分子RNA)、用沉降系數(shù)命名的7S，10SRNA等。一些生物催化劑如核酶和轉(zhuǎn)肽酶也是RNA。

　　國內(nèi)中山大學(xué)和上海生命科學(xué)院等在這些非編碼RNA的研究中做了大量工作，在國際上也占有一席之地。

　　RNA的種類可能還遠不止這些，每種RNA的功能也遠不止上面提到的那么簡單。隨著研究的深入，更多種類的RNA和RNA的功能在被詮釋。因此生命科學(xué)中的一個新的學(xué)科RNA組學(xué)（RNomics）正在興起。

　　勿容質(zhì)疑的現(xiàn)實是：在所有種類RNA功能等的研究中，mRNA的表達研究是最主要的熱點。特定生物的基因在不同發(fā)育階段、不同生理病理條件、不同細胞類型中的表達不盡相同，了解基因表達的開放與否和表達水平高低對闡明基因的功能至關(guān)重要。mRNA表達研究的傳統(tǒng)技術(shù)如Northern、原位雜交和定量RT-PCR等低通量技術(shù)適于少量基因的表達研究。但我們知道：參與任何一個生命過程的基因種類都有很多，因此低通量技術(shù)已經(jīng)不適合大量基因表達的研究，高通量研究基因表達的技術(shù)應(yīng)運而生，在這些技術(shù)中，DD-PCR和SSH技術(shù)操作復(fù)雜，假陽性率很高；因此近二十年來發(fā)展起來的DNA微陣列技術(shù)尤其是全DNA微陣列技術(shù)目前成為獲得基因表達信息的最好技術(shù)平臺，該技術(shù)可以在盡可能短的時間內(nèi)篩選出參與一個生命過程的所有的基因的表達數(shù)據(jù)。

DNA微陣列技術(shù)主要有兩種：cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列。在cDNA 微陣列中，每個基因的探針為cDNA或基因的一段PCR產(chǎn)物；這種探針設(shè)計策略很難特異區(qū)分諸如RNA剪接體、重疊基因和G蛋白偶聯(lián)受體等同源基因。寡核苷酸微陣列技術(shù)又包括兩種：約70mer的寡核苷酸微陣列和Affymetrix 25mer寡核苷酸基因芯片（Genechip）。在70mer微陣列中，每個基因的探針為該基因的一段70mer的特異寡核苷酸片段。在Affymetrix基因芯片中，每個基因都有10-20個特異探針(PM探針)，每個探針為25mer的寡核苷酸片段;每個探針還有對應(yīng)的錯配(MM)探針。探針特異性由大到小的排序為：25mer>70mer>cDNA。因此，Affymetrix基因芯片技術(shù)可以保證基因表達檢測的最好特異性。由于MM探針可以有效扣除總雜交信號中的背景信號，得到真正的雜交信號，因此Affymetrix基因芯片技術(shù)還可以保證基因芯片檢測的高靈敏度，這里的高靈敏度指可以檢測到低豐度表達的基因，也同時指低豐度表達的基因的表達水平發(fā)生變化時可以被檢測出來。目前看來，Affymetrix基因芯片技術(shù)可以保證基因表達檢測的最好特異性、最高靈敏度、最好的重復(fù)性和可靠性及最好的定量分析。因此Affymetrix基因技術(shù)得到的基因表達信息基本沒有必要通過定量RT-PCR、原位雜交和Northern等技術(shù)來驗證。

　　當然，Affymetrix基因芯片技術(shù)的局限性在于該技術(shù)依賴基因組序列信息。如果一個物種的基因組序列信息已知，Affymetrix就可以通過學(xué)等設(shè)計代表每一個基因的特異的探針。盡管Affymetrix芯片涉及的物種已經(jīng)居全球首位（Affymetrix公司目前能提供的物種信息見本刊后面的專題介紹），由于很多生物沒有序列信息，高通量研究這些生物的基因表達信息還只能依賴構(gòu)建cDNA文庫并制作cDNA微陣列，這樣得到的基因表達信息需要通過定量RT-PCR、原位雜交和Northern等技術(shù)來驗證。

　　基因得到的基因表達數(shù)據(jù)很豐富，通過學(xué)可以得到其中最具有價值的信息，比如哪些基因可能與研究者研究的生理或病理現(xiàn)象直接相關(guān)。對于這些重要基因的功能的研究，下一步的技術(shù)包括RNAi（本刊中有多篇專題介紹），基因敲除和技術(shù)等。而基因功能的最終闡明需要結(jié)合蛋白質(zhì)（組）的研究等。

最后需要指出的是，不同細胞類型在不同生理或病理條件下或在不同的發(fā)育階段，其基因表達情況不盡相同，如果采取勻漿技術(shù)獲得含多種類型細胞的組織中的mRNA并雜交基因芯片，那么得到的數(shù)據(jù)無法精確解釋每一類細胞的基因表達情況。建立細胞類型特異性的基因表達數(shù)據(jù)對研究生命現(xiàn)象的分子機理很重要，可以通過激光顯微切割（laser microdissection， LMD，詳見本刊專題介紹）技術(shù)將一個組織中不同類型的細胞進行分離，從不同細胞類型中分別得到各自的mRNA，然后分別雜交基因。當然，LMD技術(shù)對建立細胞特異性的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)信息也至關(guān)重要。