非標(biāo)記的、動態(tài)實(shí)時細(xì)胞分析檢測技術(shù)

羅氏xCELLigence: 非標(biāo)記的、動態(tài)實(shí)時細(xì)胞分析檢測技術(shù)

目前，大部分細(xì)胞檢測方法采用的仍是傳統(tǒng)的終點(diǎn)法----僅僅給實(shí)驗(yàn)定格了一個最終結(jié)果，而且經(jīng)常需要標(biāo)記和破壞細(xì)胞。這就是當(dāng)前細(xì)胞分析方法的最大限制，因?yàn)榧?xì)胞是活體，其生物學(xué)和細(xì)胞進(jìn)程是動態(tài)而非靜態(tài)的。因此，為了更充分的了解和測量生物學(xué)和細(xì)胞進(jìn)程，應(yīng)當(dāng)使用一種非侵入性的系統(tǒng)，來記錄細(xì)胞應(yīng)答某些刺激(如藥物處理或某種生長因子刺激)時所產(chǎn)生的動態(tài)變化。

作為無標(biāo)記生物檢測技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)創(chuàng)新，羅氏應(yīng)用科學(xué)部的xCELLigence系統(tǒng)提供這樣一種無需標(biāo)記、同時又可對細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測的新型細(xì)胞分析平臺。細(xì)胞接種在96微孔E-plate中，在每個孔的底部有嵌入的微電子感應(yīng)器，微電極阻抗主要由點(diǎn)及周邊的離子環(huán)境決定，當(dāng)電場加在上面的時候可以測量到一個基線阻抗，細(xì)胞的有無以及貼壁程度的改變都會影響電極傳感器表面電子和離子的通過。因此，細(xì)胞在檢測板上的貼壁、黏附、生長等狀況與傳感器所測量得到的阻抗相對應(yīng)。根據(jù)阻抗得到的指數(shù)，反映了細(xì)胞增殖、存活、凋亡、形態(tài)變化等細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)。

（圖1）

圖 1: E-plate 底部的交叉微電極工作原理示意圖。貼壁生長的哺乳動物細(xì)胞與微電級間的相互作用產(chǎn)生的阻抗與孔內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞黏附質(zhì)量相關(guān)；阻抗的大小用細(xì)胞指數(shù)（CI）進(jìn)行衡量。

傳感器阻抗技術(shù)在細(xì)胞分析中的應(yīng)用具有其特有的優(yōu)勢。第一個也是最重要的，細(xì)胞傳感器阻抗為整個實(shí)驗(yàn)全程包括細(xì)胞粘附、增殖和融合提供了全程無損傷性的細(xì)胞監(jiān)控。實(shí)時的監(jiān)控為同一個實(shí)驗(yàn)中和不同實(shí)驗(yàn)間的細(xì)胞提供了出色的質(zhì)量控制。另外，因?yàn)橛辛藢?shí)時、連續(xù)顯示的數(shù)據(jù)，就可以更自信地操作和處理細(xì)胞，而不是假定細(xì)胞處于合適的處理階段。有了阻抗讀數(shù)以及實(shí)時獲取和顯示的數(shù)據(jù)的特性，每一步處理結(jié)果都可以通過機(jī)理來預(yù)測。最后，因?yàn)樽x數(shù)是非損傷性的，傳統(tǒng)的終點(diǎn)分析仍然可以繼續(xù)結(jié)合阻抗讀數(shù)來決定進(jìn)行傳統(tǒng)終點(diǎn)分析的最佳時間點(diǎn)。

基于xCELLigence的技術(shù)優(yōu)勢，該系統(tǒng)無論是在藥物開發(fā)研究還是基礎(chǔ)生命科學(xué)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域：

藥物研發(fā) ● 藥物毒理學(xué)分析 ● 環(huán)境毒理學(xué) ● 抗腫瘤藥物篩選和研制 ● 抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選和研究 ● 抗腫瘤藥物療效觀察 ● 神經(jīng)營養(yǎng)藥物的篩選和研究 ● 現(xiàn)代中藥的開發(fā)和藥理機(jī)制分析 ● 基因診斷及藥物療效的基因?qū)W分析 ● G-蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)疾病藥物的篩選和研究 基礎(chǔ)研究 ● 細(xì)胞生長、分裂和死亡的機(jī)制研究 ● 細(xì)胞生長、分化微環(huán)境研究 ● 細(xì)胞表面受體配體結(jié)合研究 ● 細(xì)胞生長因子的生物學(xué)功能研究 ● 細(xì)胞質(zhì)量控制 ● 基因功能研究 ● 細(xì)胞粘附和細(xì)胞伸展 ● 受體介導(dǎo)的信號通路

為了展示xCELLigence系統(tǒng)在細(xì)胞分析方面的功能，以下就其幾個方面的突出應(yīng)用做簡要介紹。

細(xì)胞增殖和毒性的動態(tài)監(jiān)控
利用多種癌癥細(xì)胞系模型進(jìn)行的細(xì)胞增殖分析是評估不同抗癌化合物的效能的基礎(chǔ)分析方法之一。xCELLigence系統(tǒng)可用來定量和動態(tài)地檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。每種細(xì)胞都有獨(dú)特的增殖曲線，增殖曲線取決于接種密度。這個獨(dú)特的生長曲線可作為細(xì)胞系質(zhì)量控制的測量，來確保同一實(shí)驗(yàn)和不同實(shí)驗(yàn)間的一致性（圖2）。

圖 2: NIH3T3 和 HT1080細(xì)胞的動力學(xué)增殖曲線：a. 細(xì)胞黏附和延展階段 b. 每個細(xì)胞株特有的停滯階段 c. 指數(shù)生長期 d.融合階段

受體活性的功能監(jiān)測
G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)，市場上大約50%的藥物都是針對GPCR的。已知GPCR會調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架，因此可以利用這個信息來作為GPCR活性的功能和生物相關(guān)的參照。如圖3a所示，表達(dá)人H1組胺受體的CHO-K1細(xì)胞接種在E微孔板中，并用組胺刺激。組胺誘導(dǎo)產(chǎn)生了一個與肌動蛋白細(xì)胞骨架重排相關(guān)的瞬時的細(xì)胞信號（圖3b）。對組胺濃度取對數(shù)與最大細(xì)胞反應(yīng)做圖，就產(chǎn)生了一個EC50值的劑量應(yīng)答曲線（圖3c）。xCELLigence系統(tǒng)對于GPCR分析最大的貢獻(xiàn)有幾部分：首先，因?yàn)樽x數(shù)是非損傷性的，細(xì)胞可以在多個時間點(diǎn)進(jìn)行刺激評估脫敏作用和其他受體類型的干擾。第二，除了偶聯(lián)Gq亞家族G蛋白的組胺受體，表達(dá)其他偶聯(lián)Gs和Gi受體的細(xì)胞也可以用xCELLigence系統(tǒng)來監(jiān)測。以前進(jìn)行不同信號通路的GPCR分析需要幾個不同的儀器。第三也是最重要的，表達(dá)內(nèi)源GPCR的細(xì)胞包括原代細(xì)胞也可以用xCELLigence系統(tǒng)來分析，無需過表達(dá)外源GPCR或改造細(xì)胞表達(dá)多種GPCR。這樣就可以真實(shí)評估生理?xiàng)l件適當(dāng)?shù)募?xì)胞類型的受體。除了GPCR，其他重要藥物靶點(diǎn)的受體類型，比如酪氨酸激酶受體，也可以通過xCELLigence系統(tǒng)來進(jìn)行細(xì)胞功能的分析。

圖 3: GPCR活化的功能檢測。(a) 表達(dá)組蛋白H1受體的CHO-K1細(xì)胞接種到E-Plates上并持續(xù)觀察。在所示的時間點(diǎn)加入100 nM組胺，使用xCELLigence監(jiān)控細(xì)胞動力學(xué)響應(yīng)。(b) 表達(dá)組蛋白H1受體的CHO-K1接種到16孔板上，與(a)同樣的時間點(diǎn)加入100nM組胺。細(xì)胞固定15分鐘后，使用FITC-Phalloidin染色肌動蛋白細(xì)胞骨架，用熒光顯微鏡拍照。(c) xCELLigence檢測到的組胺劑量與響應(yīng)相關(guān)曲線。

細(xì)胞粘附與伸展
細(xì)胞粘附是多個生理學(xué)和病理學(xué)進(jìn)程的重要組成部分，例如傷口愈合、炎癥、血管生成和癌癥。細(xì)胞與不同生物表面的相互作用以及粘附是一個動態(tài)的綜合的過程，需要特殊細(xì)胞表面受體、結(jié)構(gòu)蛋白、信號蛋白和細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架的參與。為了展示xCELLigence系統(tǒng)在動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞粘附上的作用，E-plate孔中包被了濃度遞增的胞外基質(zhì)蛋白，纖連蛋白。另一些孔中包被了牛血清白蛋白（BSA）作為對照。將經(jīng)過血清饑餓處理和溫和胰酶處理的COS-7細(xì)胞加入這些包被過的孔中，用xCELLigence系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測細(xì)胞粘附和細(xì)胞伸展的過程（圖 4）。濃度遞增的纖連蛋白使細(xì)胞指數(shù)增加，而BSA則不支持細(xì)胞的粘附與伸展。因此，xCELLigence系統(tǒng)可以用來評估細(xì)胞骨架藥物、酶和信號蛋白抑制劑、生理上干擾或阻礙細(xì)胞粘附與伸展或干擾下游信號通路的藥劑的功效。

圖 4: 在嵌有微電級的E-plate上分別涂布0μg/ml到20 μg/ml濃度逐級升高的fibronectin，加入分離的血清饑餓處理NIH3T3，細(xì)胞的黏附及延展過程被xCELLigence系統(tǒng)記錄。
以上一些關(guān)鍵的重要的觀察數(shù)據(jù)的提供，展示了xCELLigence系統(tǒng)在定量的、非入侵性的、實(shí)時細(xì)胞分析上的作用。非標(biāo)記技術(shù)、非損傷性的讀數(shù)以及動力學(xué)的結(jié)合最大程度地獲得高信息量和高內(nèi)涵的數(shù)據(jù)，讓使用者們對他們的分析以及分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量做出很好的判斷。xCELLigence系統(tǒng)提供的時間分辨可以作為一個重要的工具來更好的完善分子實(shí)驗(yàn)譬如基因表達(dá)圖譜，我們期待這些技術(shù)在未來的整合。

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