BioDev Faster Taq——由普通PCR向快速PCR的革命

北京博大泰恒生物技術(shù)有限責(zé)任公司--供稿

一個(gè)PCR反應(yīng)的總耗時(shí)取決于變性、退火、延伸中每一個(gè)步驟所需的時(shí)間和從一個(gè)步驟到下一個(gè)步驟的溫度變化幅度�，F(xiàn)有的快速PCR儀和特殊PCR管等，通過(guò)特殊的加溫和降溫技術(shù)，提高溫度升降幅度和減少熱傳導(dǎo)時(shí)間，從而縮短PCR過(guò)程中PCR變化所需的時(shí)間。也有采用特殊試劑促進(jìn)引物和模板的結(jié)合或通過(guò)減少反應(yīng)體積縮短PCR時(shí)間的方法。這些方法需要購(gòu)買特殊的儀器、耗材、試劑，不具有普遍性，而且對(duì)PCR的改進(jìn)受到Taq DNA聚合酶本身擴(kuò)增性能的限制，縮短PCR反應(yīng)時(shí)間有限，而且會(huì)常常會(huì)影響到PCR的擴(kuò)增效率。

博大泰恒公司投入巨大精力研發(fā)的快速Taq酶系列——BioDev Faster Taq，將從根本上實(shí)現(xiàn)快速PCR。博大公司通過(guò)對(duì)94 kD普通Taq酶進(jìn)行精簡(jiǎn)和優(yōu)化，同時(shí)對(duì)部分結(jié)構(gòu)進(jìn)行定點(diǎn)突變，形成了全新的70 kD DNA聚合酶，F(xiàn)aster Taq在擴(kuò)增速度、擴(kuò)增效率、特異性以及酶本身的穩(wěn)定性都顯著優(yōu)于普通Taq酶，是與現(xiàn)有DNA聚合酶有本質(zhì)區(qū)別的第二代DNA聚合酶。Faster Taq的聚合速度是普通Taq的2-4倍，延伸時(shí)間僅為普通Taq酶的1/4，而且由于Faster Taq的高活性和高擴(kuò)增效率，能有效縮短變性和退火時(shí)間，PCR總耗時(shí)僅為普通Taq的30%-40%，一般PCR（1-3 kb）均可在30分鐘完成。同時(shí)PCR的產(chǎn)量，敏感度以及特異性都得到了全面提升。BioDev Faster Taq的研發(fā)成功標(biāo)志著真正意義上快速PCR的誕生。

BioDev Faster Taq聚合速度是常規(guī)Taq酶的2-4倍
BioDev Faster Taq是由先進(jìn)的基因工程技術(shù)改造而成的新一代快速Taq酶。由于刪除了非必需的蛋白序列，酶結(jié)構(gòu)得到精簡(jiǎn)和優(yōu)化，增強(qiáng)了與DNA模板的結(jié)合能力，酶分子在模板上的移動(dòng)速度和聚合dNTP的速度都大幅提高。普通Taq酶的延伸速度一般為1 kb/1 min，F(xiàn)aster Taq的延伸速度為1 kb/10-15 sec，最快可達(dá)1 kb/5 sec，使延伸時(shí)間縮短為普通Taq的1/4。Faster Taq的比活性和擴(kuò)增效率顯著高于普通Taq酶，可以縮短變性和退火時(shí)間，進(jìn)一步減少PCR時(shí)間。如圖1所示，F(xiàn)aster Taq擴(kuò)增3 kb片段僅需38分鐘，擴(kuò)增8 kb片段僅需66 分鐘，節(jié)約時(shí)間70%以上。


圖1 Faster Taq可節(jié)約70%以上時(shí)間。Faster Taq的擴(kuò)增速度來(lái)自其自身的優(yōu)越結(jié)構(gòu)。在相同條件下擴(kuò)增5 kb片段，在延伸時(shí)間為5分鐘時(shí)，所有的Taq酶都能擴(kuò)增出目的條帶，而Faster Taq（SF/GF-Taq）的產(chǎn)量明顯優(yōu)于其它Taq酶。當(dāng)延伸時(shí)間為2分30秒時(shí)，其它Taq酶的產(chǎn)量明顯下降，F(xiàn)aster Taq的擴(kuò)增效果不受影響。當(dāng)延伸時(shí)間為1分30秒時(shí)，其它Taq酶已不能擴(kuò)增出目的條帶，F(xiàn)aster Taq的產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化（圖2）。Faster Taq的內(nèi)在性質(zhì)決定了它擁有超快的聚合速度和更高的擴(kuò)增效率。這種高速PCR可以在任何PCR儀上實(shí)現(xiàn)，無(wú)需使用特殊耗材和特殊試劑盒，無(wú)需添加儀器和設(shè)備，也不會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)。


圖2 Faster Taq延伸速度明顯快于普通Taq酶。Faster Taq（SF/GF-Taq）在相同反應(yīng)體系中擴(kuò)增5 kb片段，94℃ 20s，55℃ 2s，25個(gè)循環(huán)，延伸時(shí)間見(jiàn)圖所示。當(dāng)延伸時(shí)間縮短至1m30s時(shí)，只有Faster Taq能擴(kuò)增出目的條帶，顯示出Faster Taq的速度優(yōu)勢(shì)。

酶結(jié)構(gòu)的優(yōu)化使Faster Taq的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于普通Taq酶
Faster Taq的蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，進(jìn)行了刪除突變和對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)的點(diǎn)突變，不僅使酶的擴(kuò)增速度和擴(kuò)增效率大幅提高，而且使酶的穩(wěn)定性顯著增加，耐熱性較普通Taq酶明顯加強(qiáng)。普通Taq酶的熱半衰期為95℃ 1.6小時(shí)，F(xiàn)aster Taq為100℃ 2.5小時(shí)，95℃ 10.5小時(shí)。實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)aster Taq的擴(kuò)增效率在100℃加熱1小時(shí)后沒(méi)有明顯變化，而普通Taq酶100℃加熱1小時(shí)后已經(jīng)沒(méi)有活性（圖3）。優(yōu)秀的耐熱性能為設(shè)計(jì)和優(yōu)化PCR程序提供了廣闊的空間。在擴(kuò)增低拷貝模板時(shí)可以增加循環(huán)數(shù)至45圈，在擴(kuò)增高GC含量或有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板時(shí)，可以將變性溫度提高至96℃，確保充分變性。Faster Taq的高耐熱性不僅使Faster Taq更加穩(wěn)定，而且使Faster Taq對(duì)復(fù)雜模板的擴(kuò)增能力顯著提高。

Faster Taq的穩(wěn)定性還體現(xiàn)在對(duì)反復(fù)凍融的抵抗力上。實(shí)驗(yàn)顯示在經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融30次后，F(xiàn)aster Taq活性人沒(méi)有明顯變化，而其它的Taq酶都已經(jīng)沒(méi)有活性（圖4）。這種高穩(wěn)定性降低了酶在運(yùn)送和保存時(shí)對(duì)環(huán)境的要求，保持長(zhǎng)時(shí)間質(zhì)量穩(wěn)定，并且穩(wěn)定的活性也保證了PCR的可重復(fù)性和不同時(shí)間反應(yīng)的可比較性。


圖3 Faster Taq與普通Taq 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。Faster Taq與普通Taq在加熱前后擴(kuò)增相同的DNA片段，所有反應(yīng)條件均保持不變。100℃加熱1小時(shí)后只有Faster Taq仍保持活性，表明Faster Taq的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于普通Taq酶。


圖4 Faster Taq可耐30次以上反復(fù)凍融。將Faster Taq premix液與普通Taq premix液在-20℃與室溫之間反復(fù)凍融，在凍融前，凍容15次和30次分別取樣做PCR電泳，結(jié)果如圖所示。Faster Taq在凍融30次后仍有活性，顯示Faster Taq的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于普通Taq酶。

BioDev Faster Taq系列可全面滿足PCR實(shí)驗(yàn)需求
為了充分滿足各種類型的PCR實(shí)驗(yàn)需要，博大泰恒公司以快速Taq酶技術(shù)為核心研發(fā)了一系列的Faster Taq。Silver Faster Taq是沒(méi)有3’-5’外切酶活性的快速Taq酶，擴(kuò)增時(shí)會(huì)在片段末端加上一個(gè)A，可用于一般PCR反應(yīng)和T載體克隆。Gold Faster Taq具有3’-5’外切酶活性，其錯(cuò)配率為10-8，保真性與Pfu DNA聚合酶相當(dāng)，是目前市場(chǎng)上保真性最高的DNA聚合酶之一，并且具備Faster Taq系列快速、高效、高穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行基因克隆測(cè)序，突變等高保真實(shí)驗(yàn)的理想工具。博大泰恒公司即將推出超高保真Taq酶（HSF-Taq），錯(cuò)配率在10-9-10-10之間，能完全勝任大規(guī)模測(cè)序、分子遺傳學(xué)研究、SNP篩查等高精確的研究。

博大泰恒公司以先進(jìn)的混合酶技術(shù)研發(fā)的Long Faster Taq，專為擴(kuò)增長(zhǎng)片段研制，可以輕松擴(kuò)增10 kb以上的DNA片段，配合超長(zhǎng)擴(kuò)增緩沖液，擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá)20-40 kb，完全解決PCR長(zhǎng)片段擴(kuò)增的難題。
上述各種快速Taq酶都即將推出熱啟動(dòng)產(chǎn)品，屆時(shí)Faster Taq系列將全面解決各種PCR擴(kuò)增難題。

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