分子克隆 蛋白表達實驗指南-Molecular Cloning &protein expression

表達質(zhì)粒構(gòu)建
     表達質(zhì)粒構(gòu)建概括而言即是將GE上的目的基因插入pET28、30等表達載體上。一般插入至少2個表達載體上，提高蛋白表達的概率。
  11．T載體和表達載體雙酶切
      System（20ul）
              表達載體                  12ul
              雙酶切buffer               2ul
              限制性酶a/b               1/1ul
              ddH2O                     4ul
  T載體雙酶切10ul體系即可；表達載體切20ul體系。
  37。C水浴30min～1h
  有些限制性酶buffer需要加BSA，視情況而定。
  雙酶切后跑電泳，膠回收相應(yīng)條帶，進行連接反應(yīng)。
  
  12. 酶切產(chǎn)物的連接
  System（10ul）
                      10×連接緩沖液                      1μl
                     PCR目的片斷雙酶切產(chǎn)物             5μl
                     空質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物                   2μl
                     T4 DNA連接酶                      0.5μl
                         ddH2O                              1.5μl
  16C連接3h以上，一般3h后即可用于轉(zhuǎn)化。也可置于4C連接過夜。
  如T載體雙酶切的目的基因條帶比較淡，可以增加體積至6.5ul連接。連接時表達載體的量應(yīng)該少于T載體雙酶切產(chǎn)物的量，使之充分連接。
  
   13．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α（預(yù)開42C水浴）
       與T載體轉(zhuǎn)化相同，先轉(zhuǎn)化DH5α，篩選及擴增目的重組質(zhì)粒
       轉(zhuǎn)化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目：
  1．  目的基因引物PCR驗證
  2．  表達載體引物PCR驗證
  3．  Step2中PCR產(chǎn)物膠回收后，以膠回收為模板、基因引物進行nest PCR
  4．  小抽雙酶切驗證
  驗證后再小量抽提質(zhì)粒，保存50ul質(zhì)粒及相應(yīng)的DH5α細(xì)菌
  小抽重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21。轉(zhuǎn)化BL21后只需基因引物PCR驗證
  
  目的基因表達
  
   14．快速誘導(dǎo)表達
  快速誘導(dǎo)目的是為檢測該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導(dǎo)效率的差異。
  5．  挑單克隆菌落于7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。
  6．  37C，1mM
  IPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養(yǎng)時，細(xì)菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時加入終濃度為1mM的IPTG。
  7．  誘導(dǎo)前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600為0.4的菌加40ul
  buffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。
  8．  根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠。（50KD蛋白10％或12％）
  9．  誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液，vortex。
  10．          將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl ，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。
  11．         
  取下膠，考馬斯亮藍(lán)染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結(jié)果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。
  
  注意：
       a.記錄誘導(dǎo)后菌液的OD600
       b.SDS-PAGE結(jié)果確定蛋白誘導(dǎo)后，再進行低溫小量蛋白表達
       c.制備的兩個重組表達載體可同時進行快速誘導(dǎo)
  
  SDS-PAGE膠樣品排列：
        MarkerUII 37CUI’I’

        Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul
        UI：未誘導(dǎo)菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個
        I：誘導(dǎo)后對照，上樣10ul
        UI’, I’代表GST等空載體轉(zhuǎn)化的BL21未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的對照
       
  若表達載體是GST等大分子蛋白tag，則應(yīng)做一個誘導(dǎo)空載體的對照。SDS-PAGE時取未誘導(dǎo)的空載體和誘導(dǎo)后的空載體一起上樣（誘導(dǎo)溫度37C，IPTG
  1mM），以檢測誘導(dǎo)體系是否成功。

15. 小量蛋白誘導(dǎo)表達
      該步驟的目的是檢測蛋白是否在上清存在表達。低溫時蛋白易于表達于上清，因此小量蛋白誘導(dǎo)表達以20或30C為培養(yǎng)溫度。
  1. 挑一單克隆的菌落于5ml含有相應(yīng)的抗生素的LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。
  2.
  過夜培養(yǎng)液加入三瓶50ml含有相應(yīng)的抗生素LB錐形瓶中（用250ml以上錐形瓶搖菌，保證培養(yǎng)液體積不超過菌液體積的25％，給細(xì)菌良好的生長環(huán)境），20/30℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.4-0.6。一般轉(zhuǎn)種誘導(dǎo)的比例為1：100，或者1：50(實際條件數(shù)可根據(jù)情況調(diào)整，如IPTG梯度、延遲誘導(dǎo)，加無水乙醇等)
  3.  取1ml培養(yǎng)液測其OD600值，收集細(xì)菌，按1ml菌液×OD600加入100μl的比例加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。
  4. 誘導(dǎo)時加入相應(yīng)的IPTG濃度(0.1, 0.5,
  1mM)，20/30℃振蕩培養(yǎng)。每隔1h取1ml樣品，以觀察目的蛋白表達是否會在一定時間降解，誘導(dǎo)4h左右。若IPTG濃度較低，如0.01,0.001mM，可誘導(dǎo)過夜。(低IPTG濃度可降低目的蛋白合成的速度，使細(xì)菌有相對充分的時間對目的蛋白進行折疊，形成可溶蛋白)
  5. 根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠。（50KD蛋白10％或12％）
  6. 誘導(dǎo)大約4h后收集菌液，取40ml菌液于50ml離心管中，7000rpm，15min，4C。去上清，離心管置于冰上15min。
  7. 以每100ml OD600為1.5菌液加入4ml 1×PBS的比例重懸濕菌，先用槍頭打碎菌塊，再vortex
  1×PBS中可加入低濃度變性劑如Triton-100（0.1%-3%）, Triton-100等幫助目的蛋白融解，同時不會影響目的蛋白活性。
  8. 超聲破碎前加入終濃度為1mM的PMSF或其他蛋白酶抑制劑，防止目的蛋白降解。PMSF有劇毒，拿裝PMSF的試管時必須帶上手套。
  9. 取1ml PBS重懸菌液于1.5ml
  EP管中超聲，超聲時EP管置于冰上（超聲時不定期查看，防止EP管掉入冰水中）。10s超聲，15s間隔，200w，20－25次。剩余的重懸菌液4C保存，作為誘導(dǎo)后的對照。若制備的超聲后樣品需過夜，過夜前再加入一定量的PMSF。PMSF在水中不穩(wěn)定，活性時間僅為數(shù)小時。
  10. 4C，12000rpm，15min。上清置入新EP管中，沉淀用1ml PBS充分重懸。
  11. 取10ul超聲前、超聲后的上清和重懸沉淀上SDS-PAGE。
  12. 將收集的菌液在水中煮5min，按照相應(yīng)的要求上樣 ，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。
  13.
  取下膠，考馬斯亮藍(lán)染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結(jié)果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。
          
  注意：
  a. 20C誘導(dǎo)前可以使細(xì)菌先37C培養(yǎng)，加快細(xì)菌生長速度。但誘導(dǎo)前30min必須在20C培養(yǎng)，以使細(xì)菌適應(yīng)20C的生長環(huán)境。
  b. 在處理蛋白的過程中，盡量在冰上操作，避免蛋白變性或降解。
  c.
  在蛋白表達中，小量表達摸索條件是非常關(guān)鍵的，往往也是耗費時間最多的步驟，為了能在上清中獲得目標(biāo)蛋白，有必要對每一個表達的蛋白摸索以下條件：IPTG濃度(最好過夜)，溫度，乙醇，延遲誘導(dǎo)(OD為1.0時誘導(dǎo))等。同時在處理蛋白時，也應(yīng)用1％～3％的triton-100摸索條件。
  
  
  
  
  SDS-PAGE膠樣品排列：
        MUIBS1S1P1BS2S2P2UIT1T2T3T4

           M：marker；上樣10ul
  UI：未誘導(dǎo)對照；10ul
  BS：超聲前樣品；10ul
  S：超聲后上清； 10ul
  P：超聲后沉淀； 10ul
  T：誘導(dǎo)后每隔1h樣品，10ul
  BS1，BS2表示誘導(dǎo)時IPTG濃度不同的兩種誘導(dǎo)條件樣品。S和P后的數(shù)字同理，Ti表示時間間隔為1h的誘導(dǎo)后樣品。
  
  增加目的蛋白以活性形式上清表達的方法
  1． 
  低溫誘導(dǎo)（15-30C）。37C誘導(dǎo)時大腸桿菌的代謝合成很快，使目標(biāo)蛋白來不及充分折疊就形成包涵體。低溫使細(xì)菌蛋白合成減慢，可能使蛋白表達在上清中。以及低溫可以啟動hsps的表達。該法可以與降低IPTG濃度同時使用。IPTG濃度降低可減少目的蛋白的誘導(dǎo)量。
  2．  加入DNase/RNase，防止蛋白因與DNA/RNA結(jié)合生成IBs。
  3．  超聲前或超聲后加入低濃度的表面活性劑，如2％Triton
X-100，Tween-20等。這些活性劑能使一部分IB形式的蛋白融解，同時不影響蛋白活性。
  4． 
  加入1-3%乙醇(v/v)，使大腸桿菌中hsps蛋白表達。Hsps蛋白可幫助蛋白折疊。乙醇的加入可將上清蛋白表達量增加2-3倍。由于hsps蛋白的表達在加入乙醇后20-30min，因此加入乙醇應(yīng)在IPTG誘導(dǎo)前30min。該法只能少量提高目的蛋白在上清的表達量。
  5．  加入終濃度為0.4M的蔗糖�；蛘咛鸩藟A和山梨醇�！犊贵w工程藥物》
  6． 
  更換帶有在大腸桿菌中高度表達的蛋白tag的表達載體，如GST（26KD），Nus（50KD），或使目的蛋白分泌到胞外的tag，如pelB/ompT（22aa），Dsb（26KD）等。
  7．  在培養(yǎng)基中加1-2％的葡萄糖可以抑制lac啟動子引發(fā)的本底表達，而不會影響IPTG誘導(dǎo)的由tac啟動子控制的表達。

表達質(zhì)粒構(gòu)建
     表達質(zhì)粒構(gòu)建概括而言即是將GE上的目的基因插入pET28、30等表達載體上。一般插入至少2個表達載體上，提高蛋白表達的概率。
  11．T載體和表達載體雙酶切
      System（20ul）
              表達載體                  12ul
              雙酶切buffer               2ul
              限制性酶a/b               1/1ul
              ddH2O                     4ul
  T載體雙酶切10ul體系即可；表達載體切20ul體系。
  37。C水浴30min～1h
  有些限制性酶buffer需要加BSA，視情況而定。
  雙酶切后跑電泳，膠回收相應(yīng)條帶，進行連接反應(yīng)。
  
  12. 酶切產(chǎn)物的連接
  System（10ul）
                      10×連接緩沖液                      1μl
                     PCR目的片斷雙酶切產(chǎn)物             5μl
                     空質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物                   2μl
                     T4 DNA連接酶                      0.5μl
                         ddH2O                              1.5μl
  16C連接3h以上，一般3h后即可用于轉(zhuǎn)化。也可置于4C連接過夜。
  如T載體雙酶切的目的基因條帶比較淡，可以增加體積至6.5ul連接。連接時表達載體的量應(yīng)該少于T載體雙酶切產(chǎn)物的量，使之充分連接。
  
   13．連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α（預(yù)開42C水�。�
       與T載體轉(zhuǎn)化相同，先轉(zhuǎn)化DH5α，篩選及擴增目的重組質(zhì)粒
       轉(zhuǎn)化DH5α后挑6～8個菌落驗證，驗證項目：
  1．  目的基因引物PCR驗證
  2．  表達載體引物PCR驗證
  3．  Step2中PCR產(chǎn)物膠回收后，以膠回收為模板、基因引物進行nest PCR
  4．  小抽雙酶切驗證
  驗證后再小量抽提質(zhì)粒，保存50ul質(zhì)粒及相應(yīng)的DH5α細(xì)菌
  小抽重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌BL21。轉(zhuǎn)化BL21后只需基因引物PCR驗證
  
  目的基因表達
  
   14．快速誘導(dǎo)表達
  快速誘導(dǎo)目的是為檢測該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達重組蛋白，并確定在不同IPTG濃度蛋白誘導(dǎo)效率的差異。
  5．  挑單克隆菌落于7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。
  6．  37C，1mM
  IPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養(yǎng)時，細(xì)菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時加入終濃度為1mM的IPTG。
  7．  誘導(dǎo)前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1ml OD600為0.4的菌加40ul
  buffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。
  8．  根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠。（50KD蛋白10％或12％）
  9．  誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液，vortex。
  10．          將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl ，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。
  11．         
  取下膠，考馬斯亮藍(lán)染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結(jié)果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。
  
  注意：
       a.記錄誘導(dǎo)后菌液的OD600
       b.SDS-PAGE結(jié)果確定蛋白誘導(dǎo)后，再進行低溫小量蛋白表達
       c.制備的兩個重組表達載體可同時進行快速誘導(dǎo)
  
  SDS-PAGE膠樣品排列：
        MarkerUII 37CUI’I’

        Marker：低分子量蛋白marker，上樣10ul
        UI：未誘導(dǎo)菌液，上樣10ul。任取37C和20C中一個
        I：誘導(dǎo)后對照，上樣10ul
        UI’, I’代表GST等空載體轉(zhuǎn)化的BL21未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的對照
       
  若表達載體是GST等大分子蛋白tag，則應(yīng)做一個誘導(dǎo)空載體的對照。SDS-PAGE時取未誘導(dǎo)的空載體和誘導(dǎo)后的空載體一起上樣（誘導(dǎo)溫度37C，IPTG
  1mM），以檢測誘導(dǎo)體系是否成功。

 18．活性親和層析
           適用蛋白：任何表達在上清的融合蛋白
  下面以GST tag為例(GST tag一般需要切除，事先應(yīng)確認(rèn)所表達蛋白上沒有thrombin等蛋白酶位點)
       
        Column Purification
     1. Use a pipet to apply the bacterial sonicate (Procedure 11,page 15) to a
  column of drained and washed Glutathione Sepharose 4B RediPack or Disposable
  Column (Procedure 8, page 13).
  – Note: If needed, the sonicate may be clarified by filtrationthrough a 0.45
  µm filter before applying it to the column.
  2. Remove the end cap and allow the sonicate to flow through the column.
  – Note: The majority of the eluate can be discarded. However, a sample should
  be
  retained for analysis by SDS-PAGE (see Figure 7; see also Figure 8, page 19)
  or CDNB
  assay (Procedure 17, page 21) to measure the efficiency of binding to the
  matrix.
  3. Wash the matrix by the addition of 10 bed volumes* of 1X PBS. Allow the
  column to drain. Repeat twice more for a total of three washes.
  – Note: Fusion protein bound to the matrix may be eluted directly at this
  stage using Glutathione Elution Buffer (see “Column Elution”), or the protein
  may be cleaved on the matrix with PreScission Protease, thrombin or factor Xa
  to liberate the protein of interest from the GST moiety. [Refer to Procedure
  14, PreScission Protease Cleavage (page 17), Procedure 15, Thrombin Cleavage
  (page 18), or to Procedure 16, Factor Xa Cleavage (page 19).
  4. Once the column with bound protein has been washed and drained, replace the
  bottom cap.
  5. Elute the fusion protein by the addition of 1 ml of Glutathione Elution
  Buffer per ml bed volume. Incubate the column at room temperature (22-25°C)
  for 10 minutes to elute the fusion protein.
  6. Remove the bottom cap and collect the eluate. This contains the fusion
  protein.
  7. Repeat the elution and collection steps twice more. Pool the three eluates.
  – Note: Following the elution steps, a significant amount of fusion protein
  may remain bound to the matrix. Volumes and times used for elution may vary
  among fusion proteins. Additional elutions may be required. Eluates should be
  monitored for GST fusion protein by SDS-PAGE (see Figure 7, page 16; see also
  Figure 8,page 19) or by CDNB assay (Procedure 17, page 21).
  – Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the
  absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 Å 0.5
  mg/ml. (This is based on the extinction coefficient of the GST monomer using a
  Bradford protein assay. Other protein determination methods may result in
  different extinction coefficients.).
  –         Note: The yield of protein may also be determined by standard
  chromogenic methods (e.g., Lowry, BCA,Bradford, etc.). If a Lowry or BCA type
  method is to be used, the sample must first be dialyzed against 2000 volumes
  of 1X PBS to remove glutathione, which can interfere with protein measurement.
  The Bradford method can be performed in the presence of glutathione.
  
  Thrombin Cleavage of Fusion Protein Bound to Column/Bulk Matrix
  1. Prepare the thrombin reaction mixture as follows: For each ml of
  Glutathione Sepharose bed volume*, mix 50(25) μl (U) of thrombin solution and
  950 μl of 1X PBS. (When using Thrombin cleavage, 25ul thrombin can be used for
  cleavage of 1 ml bed volume. There would be only 0.8mg difference in
  concentration of the eluted protein. Thus, for the sake of thrift, 25ul
  thrombin enzyme is equally enough. The price for 50U thrombin is 70RMB)
  2.  Replace the bottom cap on the washed column from Procedure 12, step 6 or
  Procedure 13, step 3 and add the Thrombin Protease mixture. If batch format is
  used, add Thrombin Protease mixture to Glutathione Sepharose pellet. Gently
  shake or rotate the the suspension at room temperature for 2-16 hours. (In the
  aim of reducing protein degradation, condition of 10~26h in 4C is recommended
  for the complete and thorough digestion of the target protein)
  3. Following incubation, remove the bottom cap and collect the eluate in a
  clean tube. If batch format is used, centrifuge the suspension at 500 x g for
  5 minutes to pellet the Sepharose beads and carefully transfer the eluate to a
  clean tube. The eluate will contain the protein of interest while the GST
  portion of the fusion protein remains bound to the Glutathione Sepharose
  matrix.
  
   19. 割膠回收
  預(yù)先配制20cm×20cm的SDS-PAGE膠，并且割膠前先提前一天跑一塊相同濃度的SDS-PAGE小膠，用于計算大膠上目的蛋白的比例。
   適用蛋白：表達在IB中，tag為大分子蛋白，如GST等。
  1．  用不同濃度梯度（1M, 2M, 4M,
  8M）的urea緩沖液洗滌包涵體，除去多余的雜蛋白，割膠時能減少雜蛋白的共純化。Urea梯度選擇能保留目的蛋白于IB中的最大濃度。
  2．  用step1摸好的urea條件重懸超聲離心后的IB，vortex使充分溶解。
  3．  12000rpm, 10min,4C，去除不溶于urea的細(xì)胞雜質(zhì)。
  4．  取4－5ml離心后的上清，加入SDS-PAGE loading buffer至1×。沸水浴5min（最好將其分裝于1.5ml
  EP管中，使水浴時充分受熱）。其余-20C保存。
  5．  水浴后上樣，200V，3－4h至溴芬藍(lán)染料走到SDS-PAGE膠底。
  6． 
  取5－7cm的半透膜，沸水浴5min，之后放入蛋白電泳buffer中。電透析tube和frit也放入buffer中。浸泡5min除去半透膜，frit，tube上的微小氣泡后，將frit放入tube帶磨沙的開口中，深入大約0.2～0.5cm（若插入太高，會導(dǎo)致最終電透析后的蛋白濃度較低，不滿足打抗體的1mg/ml濃度）。之后小心的將半透膜套在放了frit的tube開口上，用橡皮筋將半透膜套緊。盡量杜絕frit和半透膜之間的氣泡，它會影響透析的效率。
  7． 
  電泳結(jié)束后，按比例從膠上割下相應(yīng)約1cm條帶（當(dāng)按比例的條帶割下后可相應(yīng)的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。
  8．  將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。
  9．  移出放電透析tube的架子，用注射器將tube上部的buffer吸掉。之后小心的在下部半透膜上插入注射器針頭，緩緩析出其中的蛋白溶液。
  10．吸取的蛋白溶液轉(zhuǎn)入1.5ml EP管中，取20ul用于SDS-PAGE純度驗證，其余的-20C保存。
         割膠的比例計算：
           小膠（染色后）：                          大膠（未染色）：
                分離膠頂部―――――                分離膠頂部―――――                          
          A cm                                                 
     目的蛋白位置――――  B cm    C cm    目的蛋白位置？                             
                             
     溴芬藍(lán)底部位置―――                溴芬藍(lán)底部位置――――
  
  簡單的比例計算即可得到大膠上目的蛋白的位置。

20．純化后蛋白SDS-PAGE驗證純度
      SDS-PAGE方法如前所述，該結(jié)果必須拍照存檔, 格式如下：
   
  Lane1～5：Marker、未誘導(dǎo)、誘導(dǎo)后、上清、沉淀
  Lane6～9：純化后蛋白依次按1.5, 0.75, 0.375, 0.187mg/ml上樣，10ul each lane.
       當(dāng)lane 8看不到雜帶時，蛋白純度才符合要求
  
  21. 其他常用操作及知識
  SDS-PAGE：
  蛋白質(zhì)如果能融解在SDS溶液中，則它們可以按分子質(zhì)量的大小加以分離。這種方法的原理為小分子質(zhì)量的SDS與蛋白質(zhì)的疏水基團結(jié)合，破壞了蛋白質(zhì)的層疊結(jié)構(gòu)，使它以舒展態(tài)穩(wěn)定地存在于溶液中，每克蛋白質(zhì)約結(jié)合1.4gSDS。SDS分子以它自己地負(fù)電荷掩蓋了蛋白質(zhì)分子原來存在的電荷，各種蛋白質(zhì)分子表現(xiàn)出的電荷密度相等，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的長度與其分子質(zhì)量成比例，電泳時，它們純粹按照分子量的大小由凝膠的分子篩效應(yīng)進行分離。
  
  層析柱的再生
  Regeneration of Ni-NTA beads(from QIAGEN):
  Handling
  Ni-NTA matrices are stable under a wide variety of conditions and need not be
  refrigerated, except to inhibit growth of microorganisms for long-term
  storage. After use they should be washed for 30 minutes with 0.5M NaOH. Ni-NTA
  matrices should be stored in 30% ethanol to inhibit microbial growth. The
  matrix can be stored for up to one week in any of the denaturing buffers.
  Reuse of Ni-NTA Resin
  The reuse of Ni-NTA resin depends on the nature of the sample and should only
  be performed with identical recombinant proteins. Based on the experience of
  Hoffmann-La Roche Ltd. (Basel, Switzerland), who have purified more than 100
  different proteins on Ni-NTA resin, we recommend a maximum of 5 runs per
  column.
  If the Ni-NTA Agarose changes from light blue to brownish-gray, the following
  regeneration procedure is recommended.
  Procedure:
  1. Wash the column with 2 volumes of Regeneration Buffer (6 M GuHCl, 0.2 M
  acetic acid).
  2. Wash the column with 5 volumes of H2O.
  3. Wash the column with 3 volumes of 2% SDS.
  4. Wash the column with 1 volume of 25% EtOH.
  5. Wash the column with 1 volume of 50% EtOH.
  6. Wash the column with 1 volume of 75% EtOH.
  7. Wash the column with 5 volumes of 100% EtOH.
  8. Wash the column with 1 volume of 75% EtOH.
  9. Wash the column with 1 volume of 50% EtOH.
  10. Wash the column with 1 volume of 25% EtOH.
  11. Wash the column with 1 volume of H2O.
  12. Wash the column with 5 volumes of 100 mM EDTA, pH 8.0.
  13. Wash the column with H2O.
  14. Recharge the column with 2 volumes of 100 mM NiSO4.
  15. Wash the column with 2 volumes of H2O.
  16. Wash the column with 2 volumes of Regeneration Buffer.
  17. Equilibrate with 2 volumes of a suitable buffer (e.g., Buffer A or B).
  
  Regeneration of Glutathione Sepharose 4B(GST)
  Glutathione Sepharose 4B may be regenerated for re-use by washing the gel with
  2-3 bed volumes(Bed volume is equal to 0.5 x the volume of the 50% Glutathione
  Sepharose slurry used or 0.75 x the volume of the originalGlutathione
  Sepharose slurry) of alternating high pH (0.1 M Tris-HCl + 0.5 M NaCl, pH 8.5)
  and low pH(0.1 M sodium acetate + 0.5 M NaCl, pH 4.5) buffers. This cycle
  should be repeated 3 times followed by re-equilibration with 3-5 bed volumes
  of 1X PBS.
  If the gel appears to be losing binding capacity, it may be due to an
  accumulation of precipitated, denatured or non-specifically bound proteins.
  To remove precipitated or denatured substances, wash the matrix with 2 bed
  volumes of 6 M guanidine hydrochloride, immediately followed by a wash with 5
  bed volumes of 1X PBS.
  To remove hydrophobically bound substances, wash the matrix with 3-4 bed
  volumes of 70% ethanol or with 2 bed volumes of a non-ionic detergent (conc.
  0.1%), immediately followed by a wash with 5 bed volumes of 1X PBS.
  For long-term storage (>1 month), the following procedure of additional washes
  is recommended:
  1. Wash the gel twice with 10 bed volumes of 1X PBS.
  2. Repeat washes using 20% ethanol.
  3. Store at +4°C.
  4. Re-equilibrate the gel with 1X PBS before re-use.
   
  
  
  RbCl制備感受態(tài)細(xì)胞
  需準(zhǔn)備的滅菌器具和培養(yǎng)液：
  SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml
  EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰
  離心管，EP管，移液管使用前均需要放在4C預(yù)冷。離心機使用前也應(yīng)預(yù)冷
  1．將DH5α(上批做好的感受態(tài)菌或保種的DH5a)劃在LB平板上，370C培養(yǎng)10-12小時
  2．挑單克隆于4ml SOB培養(yǎng)液（SOB培養(yǎng)液中的MgCl2 和MgSO4必須搖菌之前加，細(xì)菌活化也可以用LB培養(yǎng)液），370C培養(yǎng)過夜
  3．取2ml過夜菌到200ml SOB培養(yǎng)液（1000ml三角椎瓶），370C培養(yǎng)至OD600＝0.35（約1.5小時，OD最好不能超過0.4
  4．將菌迅速置于鹽冰浴上15分鐘（鹽使冰浴更冷，也可以不用鹽冰�。�，同時預(yù)冷500ml離心瓶和離心機
  5．將菌分裝于500ml離心瓶中，5000rpm，40C離心5分鐘，棄上清
  6．加入64ml Buffer1，小心的吹打細(xì)菌使之混勻（最好從瓶壁上離菌落3－4cm處吹下buffer
  1，不要直接吹打菌落，冰上操作。加buffer1時先預(yù)加30ml，當(dāng)菌落吹打均勻后再補加34ml
  buffer），冰上15min。4800rpm，40C離心5分鐘，棄上清
  7．將菌平均分裝于兩個50ml離心管中，分別加入8ml
  Buffer2，懸浮細(xì)胞，懸浮方法同step6，置冰上。立即分裝為100ul/每管（1.5ml離心管需預(yù)冷，無菌操作）
  8．分裝好的感受態(tài)菌立即放入液氮中，-700C保存
     SOB                      200ml     
        Tryptone                       4g
        Yeast extract                    1g
        NaCl                          0.12g
        KCl                           0.1g
        Autoclave                     
        用前加入 1M MgCl2 到 10mM
                 1M MgSO4到  10mM (MgCl2，MgSO4混合液過濾除菌)
  
     Buffer1               64ml
        RbCl                 0.768g
        MnCl2*4H2O           0.636g
        CaCl2*2H2O           0.096g
        Glycerol               9.6g
        KAC                 1.92ml of 1M stock PH7.5 
        0.2M Hac 調(diào)PH至5.8
        0.22um過濾器滅菌,40C保存
  
  Buffer 2              20ml
        MOPS              0.4ml  of  0.5M stock PH6.8 MOPS不能高壓滅菌
        RbCl               0.024g
        CaCl2*2H2O          0.22g
        Glycerol             3g
        0.22um過濾器滅菌,40C保存

22．常用試劑配方：
  LB液體培養(yǎng)基
          Tryptone              1g
          Yeast Extract           0.5g
          NaCl                 1g
  加蒸餾水至總體積為100ml，高壓蒸汽滅菌。
  
  LB固體培養(yǎng)基
          Tryptone              1g
          Yeast Extract           0.5g
          NaCl                 1g
  Agar                 1.5g
  加蒸餾水至總體積為100ml，高壓蒸汽滅菌。滅菌后培養(yǎng)基不燙手時加入抗生素
  
  2×YT培養(yǎng)基
          Tryptone              1.6g
  Yeast Extract           1g
  NaCl                 0.5g
  加蒸餾水至總體積為100ml，高壓蒸汽滅菌
  
  10×SDS-PAGE電泳緩沖液
        Tris堿                      60.4g
        Glycine                     376g
        SDS                        20g
        先加1.3L水，溶解后蒸餾水定容至2L
  
  蛋白脫色液
      冰醋酸100ml, 甲醇100ml, H2O至1L
  
  1×PBS緩沖液
          NaCl                         4g
          KCl                          0.1g
          Na2HPO4 · 12H2O                  1.79g
          KH2PO4                                  0.12g
         先溶于400ml蒸餾水中，調(diào)PH值7.3，加水定容至500ml，高壓滅菌
         10×PBS配置直接將相應(yīng)的成分×10，配制方法相同
  
  Tris-Cl（1M）
          用800ml蒸餾水溶解121.1g Tris base，加濃鹽酸調(diào)PH至所需值
          應(yīng)使溶液冷至室溫后，方可最后調(diào)定pH值。加水定容至1L。分裝后高壓蒸
  汽滅菌。Tris溶液的pH值因溫度而定，溫度每升高1C，pH值大約降低0.03單位
  
  6×SDS sample buffer
          甘油（100％）               30ml
          TrisCl（pH 6.8,1.0M）         15ml
          EDTA（powder）             0.22g
          SDS（powder）               6g
          溴酚藍(lán)                            0.03g
          DTT                         0.6 mol/L
        Store in aliquots at -20C
  也可保存于室溫，但是使用前加入1/20體積的巰基乙醇，使ME終濃度為715 mM
        配制時用沸水浴或電磁攪拌器加熱，燒杯頂部用錫紙封閉，防止水分蒸發(fā)
        過濾除菌
  
  30％丙烯酰胺
          丙烯酰胺                    60g
          亞甲雙丙稀酰胺              1.6g
          加蒸餾水至200ml
  
  TrisCl pH 8.8（1.5mol/L）
    在50ml蒸餾水中溶解18.2g Tris base，用1mol/L HCl調(diào)pH至8.8，補加蒸餾水至100ml。4度保存
  
  TrisCl pH 6.8 （1.0mol/L）
    在50ml蒸餾水中溶解12.1g Tris based，用HCl調(diào)pH至6.8，定容至100ml
  
  10％過硫酸胺（AP）
    1g AP溶于10ml蒸餾水中。4C不能長期存放，一般2－3周
  
  10％SDS
  稱取20gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含150ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至200ml
  
      IPTG（1 M）
        用8ml蒸餾水融解2.38g IPTG配制成1 M的溶液，用蒸餾水定溶至10ml。用0.22um過濾器過濾除菌，store -20C
       
      Amp(50mg/ml)
        溶解1g
Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基，1:1000比例稀釋
      
      Kan(50mg/ml)
        溶解1g
Kan于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養(yǎng)基，1:1000比例稀釋
  
      EB
  100ml蒸餾水中加1g EB，磁力攪拌數(shù)小時，以確保完全融解。然后用鋁箔包裹容器或?qū)⑷萜鬓D(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫保存
  
  TAE（50×）
  Tris base             242g
      冰醋酸              57.1ml
      EDTA               0.05mol
      調(diào)PH至8.5，定容至1L
  
  考馬斯亮藍(lán)R-250染色液
  乙醇                  135ml
  水                    135ml
  冰醋酸                30ml
  考馬斯亮藍(lán)R-250粉末  0.75g
        過濾除去顆粒，乙酸過濾后加入
  
      溶菌酶（10mg/ml）
        每克溶菌酶溶于100ml 10mM，PH=8.0，滅菌的TrisCl中，4C store
  
      DTT(1M)
        用20ml 0.01M乙酸鈉溶液(pH5.2)溶解3.09g DTT，過濾除菌后分裝成小份，儲存于-20C
  
  dNTPs
  100mM初濃度，按照每種20ul量加，最后定容至800ul。終濃度為每種dNTP 2.5mM
  
  PMSF(50mM)
  溶解87mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的異丙醇中，定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹，-20C保存。
     
  20% Triton-100
  20ml 100％ Triton-100溶于80ml PBS或TBS中，水浴攪拌融化。使用時加至所需終濃度
  
  5％ X-Gal
  溶解50mg的X-Gal于1ml的DMF或DMSO中, 用鋁箔包裹裝液管，貯存于-20℃。每次配1ml，分裝。否則放在-20C X-Gal最多保存4個月
  
  Glutathione Elution Buffer
     10 mM reduced glutathione in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). Dispense in 1-10 ml
  aliquots and store at -20°C until needed. Avoid more that five freeze/thaw
  cycles.
  (配40ml 20mM的：0.242Tris base到40ml ddwater中，PH8.0，再加glu0.246g。)
  
  Buffers for His purification in denatured conditions:
      配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調(diào)pH需要較多NaOH)，再統(tǒng)一配bufferC，D，E，分別調(diào)pH
   Buffer B (200ml):
  100 mM NaH2PO4        3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
  10 mM Tris·Cl           0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
  8 M urea                96.1 g (MW 60.06 g/mol)
  Adjust pH to 8.0 using NaOH.
          Buffer C (200ml):
  100 mM NaH2PO4        3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
  10 mM Tris·Cl           0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
  8 M urea                96.1 g (MW 60.06 g/mol)
  Adjust pH to 6.3 using HCl.
  Buffer D (200ml):
  100 mM NaH2PO4        3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
  10 mM Tris·Cl           0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
  8 M urea                96.1 g (MW 60.06 g/mol)
  Adjust pH to 5.9 using HCl.
          Buffer E (200ml):
  100 mM NaH2PO4        3.12 g NaH2PO4·2H2O (MW 156 g/mol)
  10 mM Tris·Cl           0.24g Tris base (MW 121.1 g/mol)
  8 M urea                96.1 g (MW 60.06 g/mol)
  Adjust pH to 4.5 using HCl.
        Note: Due to the dissociation of urea, the pH of Buffers B, C, D, and E
  should be
  adjusted immediately prior to use. Do not autoclave.
  
    SDS-PAGE膠配方
        SDS-PAGE分離膠配方         
         5ml8.5ml10ml15ml17.5ml20ml25ml30ml40ml50ml
        6％膠         
        水2.64.425.37.99.110.613.215.921.226.5
        30％聚丙烯酰胺混合液11.7233.5456810
        1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
        10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        TEMED0.0040.00680.0080.0120.0140.0160.020.0240.0320.04
                  
        8％膠         
        水2.33.914.66.98.059.311.513.918.523.2
        30％聚丙烯酰胺混合液1.32.212.744.555.36.7810.713.3
        1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
        10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        TEMED0.0030.00510.0060.0090.01050.0120.0150.0180.0240.03
                  
        10％膠         
        水1.93.2345.96.657.99.911.915.919.8
        30％聚丙烯酰胺混合液1.72.893.355.956.78.31013.316.7
        1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
        10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
                  
        12％膠         
        水1.62.723.34.95.66.68.29.913.216.5
        30％聚丙烯酰胺混合液23.4467810121620
        1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
        10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
                  
        15％膠         
        水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5
        30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025
        1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.51012.5
        10% SDS0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        10% AP0.050.0850.10.150.1750.20.250.30.40.5
        TEMED0.0020.00340.0040.0060.0070.0080.010.0120.0160.02
        
                  
        積層膠配方         
         1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10ml15ml
        水0.681.42.12.73.44.15.56.810.2
        30％聚丙烯酰胺混合液0.170.330.50.670.8311.31.72.55
        1M Tris(pH=6.8)0.130.250.380.50.630.7511.251.95
        10% SDS0.010.020.030.040.050.060.080.10.15
        10% AP0.010.020.030.040.050.060.080.10.15
        TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.010.015

  
     PCR體系配方
        Taq PCR              
        30ul system              
         123456789101112131415
        10×buffer369121518212427303336394245
        MgCl21.83.65.47.2910.812.614.416.21819.821.623.425.227
        dNTP1.22.43.64.867.28.49.610.81213.214.415.616.818
        primers1.22.43.64.867.28.49.610.81213.214.415.616.818
        Template123456789101112131415
        Taq0.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.63.94.24.5
        ddH2O21.54364.586107.5129150.5172193.5215236.5258279.5301322.5

  
        pfu PCR         
        50ul system         
         12345678910
        10×pfu buffer5101520253035404550
        dNTP2468101214161820
        Template2468101214161820
        primers12345678910
        pfu0.511.522.533.544.55
        ddH2O39.579119158198237277316356395

  
  10×TBS
  Tris                     24.4g
  NaCl                    80g
  定容至1L，調(diào)pH至7.6
  1×TTBS: 10×TBS稀釋后1L加1ml吐溫
  10×電轉(zhuǎn)緩沖液
            Tris                     30.2g
            Glycine                  150g
            定容至1L ，PH 8.5
  
  
  
        Phosphate (Sodium) buffer Chart
         
        Phosphate (Sodium) buffer Chart
        Stock solution A
        2 M monobasic sodium phosphate, monohydrate (276g/L) 一水磷酸二氫鈉
        Stock solution B
        2 M dibasic sodium phosphate (284 g/L). 磷酸氫二鈉
        Mixing an appropriate volume (ml) of A and B as shown in the table below
        and diluting to a total volume of 200 ml, a 1 M phosphate buffer of the
        required pH at room temperature.
         A       B        pH
         92.0    8.0     0.8
         90.0    10.0     5.9
         87.7   12.3    6.0
         85.5    15.0     6.1
         81.5    19.5     6.2
         77.5    22.5     6.3
         73.5    26.5     6.4
         68.5   31.5    6.5
         62.5    37.5     6.6
         56.5    43.5     6.7
         51.0    49.0     6.8
         45.0    55.0     6.9
         39.0   61.0    7.0
         33.0    67.0     7.1
         28.0    72.0     7.2
         23.0    77.0     7.3
         19.0    81.0     7.4
         16.0   84.0    7.5
         13.0    87.0     7.6
         10.5    89.5     7.7
         8.5     91.5     7.8
        Preparation of 0.1M potassium phosphate buffer at 25ºC
              Desired  pH  Volume of 1M K2HPO4 (mL)Volume of 1M KH2PO4 (mL)
              5.8  8.591.5
              6.0  13.286.8
              6.2  19.280.8
              6.4  27.872.2
              6.6  38.161.9
              6.8  49.750.3
              7.0  61.538.5
              7.2  71.728.3
              7.4  80.219.8
              7.6  86.613.4
              7.8  90.89.2
              8.0 94.0 6.0

        Dilute the combined 1M stock solution to 1 litre with distilled H2O

  
  在大腸桿菌中，當(dāng)外源蛋白高水平表達的時候，極易形成包涵體，為蛋白純化等下游工作帶來很大的麻煩。下面是一些可以參考的有助于提高目的蛋白可溶性表達的實驗方案：
  
  1.降低蛋白合成的速度�？梢酝ㄟ^以下方法實現(xiàn)：
    a.降低培養(yǎng)溫度
    b.使用弱啟動子
    c.使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達載體
    d.降低誘導(dǎo)物的濃度
  2.改變培養(yǎng)基。
    a.培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子
    b.加入緩沖液保持pH穩(wěn)定
    c.加入1%的葡萄糖，抑制lac啟動子
    d.加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)的因子
    e.加入乙醇， thiols and disulfides等？
  3.與分子伴侶或折疊酶共表達。
     常用的分子伴侶有：
     GroES-GroEL
     DnaK-DnaJ-GrpE
     ClpB
    常用的折疊酶有：
    peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's) 
    disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) 
    protein disulfide isomerase (PDI)
  
  4.分泌表達。使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。
     周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的形成，而胞內(nèi)則是還原性的。
     周質(zhì)空間有折疊酶DsbA和DsbC的存在，幫助蛋白正確折疊。
     周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在，不會被水解。
     可以使對細(xì)胞有毒性的蛋白大量存在。
  
  5.使用特定的菌株。
    
      AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB).
      Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione
  reductase (gor).
  
  6.與可溶性partner融合表達。
  
  7.表達目的蛋白的一個片段。> 70 kDa的蛋白在大腸桿菌中是很難表達的。
  
  8.體外去折疊，重新折疊。