核酸提取(The Extraction of Nucleic Acid)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?
1．掌握核酸提取的基本原理和基本方法
2．掌握檢測核酸濃度及純度的原理及方法
 
【實(shí)驗(yàn)原理】
DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。在DNA提取過程中應(yīng)做到：1、根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。
核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提，在單價(jià)陽離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量時(shí)，應(yīng)在260nm和280nm兩個(gè)波長下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計(jì)算樣品中的核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA及大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度。DNA及RNA純品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值分別是1.8和2.0，如果樣品中污染有蛋白或酚，其OD₂₆₀/OD₂₈₀將明顯低于此值，此時(shí)無法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。
 
【實(shí)驗(yàn)用品】
1．臺式離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計(jì)；一次性塑料手套。
2．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。
3．DNA提取的相關(guān)試劑：
1）蛋白酶K（10mg/ml）,-20℃保存。
2）TE（pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）, 15磅高壓滅菌后室溫保存。
3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加熱68℃助溶，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加蒸餾水定容至100ml，室溫保存。
4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。
5）飽和氯化鈉，70%乙醇，氯仿
6）飽和酚
 
【實(shí)驗(yàn)步驟】
飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA
1．取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；
2．室溫離心，10000rpm ，1分鐘；
3．棄上清，加入0.4ml TE(pH 8.0)，混勻，懸浮細(xì)胞；
4．加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）,10% SDS 25μl(終濃度0.5%)，混勻；
5．37℃水浴消化過夜，或50℃消化4小時(shí)；
6．加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4℃靜置10分鐘；
7．10000rpm離心10分鐘，取上清于另一新管中；
8．加入等體積氯仿，混勻，10000rpm離心10分鐘；
9．取上清于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；
10．加入2倍體積無水乙醇輕輕混合，10000rpm離心1分鐘；
11．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
12．10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然干燥DNA約5分鐘；
13．加入200-250μl TE，-20℃保存；
14．檢測濃度及純度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1．外周血反復(fù)凍溶破壞紅細(xì)胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混勻后，10000rpm 離心10分鐘；
2．棄上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）混勻；
3．37℃水浴消化過夜，或50℃消化4小時(shí)；
4．加入等體積的飽和酚并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
5．吸取上清液于另一新管中，重復(fù)上一步驟一次；
6．吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
7．吸取上清液于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后，加入2倍體積無水乙醇并輕輕混合，可見絮狀乳白色DNA團(tuán)塊，10000rpm離心10分鐘；
8．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
9. 10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TE液，-20℃保存；
10．檢測濃度及純度
組織總RNA的提取  
1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min，擊碎后回收入2ml無菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿,樣品體積不應(yīng)超過TRIZOL試劑體積的10%； 
2.將組織勻漿液在15-30℃放置5min,促使核蛋白復(fù)合物完全解離,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30℃放置10min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心10min；
4. 棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過7500g,離心5min；
5. 室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃溫浴10min).
6. 紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度和純度；
7. 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，每孔上樣25μg，65V，2.5h，以檢測RNA的質(zhì)量。
 
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】
1. 計(jì)算已提取的DNA的濃度和純度