RNAi干擾技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展研究

RNAi是Napoli CD等在試圖向紫色矮牽�；ㄞD(zhuǎn)導(dǎo)色素合成基因，用以增加其花色時(shí)發(fā)現(xiàn)的。結(jié)果出乎預(yù)料，轉(zhuǎn)基因的植株不僅沒(méi)有新基因的表達(dá)，反而自身的色素合成也減弱了，一些轉(zhuǎn)基因的花出現(xiàn)了全白色或部分白色。他們把這種導(dǎo)入的基因未表達(dá)和植物本身合成色素基因的失活現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。之后，Ramano等在向粗糙孢菌中導(dǎo)入合成胡蘿卜素的基因時(shí)造成失活，他們稱為基因靜止(quelling)。Fire A等在研究反義核苷酸時(shí)發(fā)現(xiàn)在線蟲(chóng)體內(nèi)，雙鏈RNA( double stranded RNA，dsRNA)能有效地抑制有互補(bǔ)序列的內(nèi)源性基因，且抑制效果優(yōu)于 單鏈反義RNA。至此，正式提出了雙鏈RNA誘導(dǎo)的RNAi的概念，開(kāi)啟了RNAi研究的序幕。

1 RNAi可能的作用機(jī)制及特點(diǎn)

1.1 RNAi的作用機(jī)制

雖然RNAi作用的確切機(jī)制尚不清楚，但目前普遍認(rèn)可是Bass假說(shuō)。具體概括為三個(gè)階段。

（1） 起始階段。在細(xì)胞內(nèi)，雙鏈RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的參與下被處理為21個(gè)～23個(gè)堿基的小RNA，即小干 擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA是由19個(gè)～21個(gè)堿基配對(duì)形成的雙鏈，并在其3′末端有兩個(gè)游離未配 對(duì)的核苷酸。研究發(fā)現(xiàn)， siRNA 是RNAi 作用發(fā)生的重要中間分子，序列與所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性；雙鏈的兩端各有2個(gè)～3個(gè) 突出的非配對(duì)的3′堿基；兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基。這些是細(xì)胞賴以區(qū)分真正的siRNA和其他雙鏈RNA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 研究表明，平末端的 siRNA 或失去了5′磷酸基團(tuán)的siRNA 不具有RNAi 的功能。

（2）引發(fā)階段。siRNA與Argonaute蛋白家族及 其他未知因素結(jié)合，形成siRNA-核蛋白復(fù)合物（siRNA-ribonucleoprotein complex，siRNP）。siRNP在ATP 及其他未知因素參與下，使雙鏈siRNA解旋形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RNA inducing silencing Complex ，RISC)。RISC可能以完全單鏈或兩條鏈解旋但不完全分離的形式存在，繼而 RISC在dsRNA的介導(dǎo)作用下與互補(bǔ)mRNA結(jié)合，并將其降解。mRNA被降解在轉(zhuǎn)錄后水平，抑制基因表達(dá)，因而又稱之為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 ( posttranscriptional gene silencing，PTGS)

（3）循環(huán)放大階段。在siRNA誘導(dǎo)的RNAi過(guò) 程中，可能還存在siRNA 的循環(huán)放大過(guò)程，以維持它的RNA誘導(dǎo)功能。此過(guò)程推測(cè)是以siRNA為引物，互補(bǔ)mRNA 為模板，在RNA依賴性RNA 合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase，RdRP) 的作用下，合成新的雙鏈RNA，再由Dicer作用，產(chǎn)生新的 siRNA，完成siRNA 的放大過(guò)程，開(kāi)始新的RNAi循環(huán)。

關(guān)于對(duì)RNAi機(jī)制中重要酶的作用研究，Zamore P D等發(fā)現(xiàn)，21 nt RNA指導(dǎo)mRNA的降解； Scharf W D等發(fā)現(xiàn)ATP依賴的RNA解旋酶為Mut6;Grishok A等發(fā)現(xiàn)Let-7和lin-4為內(nèi)源性的RNAi基因（stRNA）；Dalmay T等提出RNA依賴的RNA多聚酶就是SDE- 1； Bernstein E等證實(shí)RNaseш樣的核酸酶為Dicer; Elbashir S M等應(yīng)用外源性21 nt- siRNA能夠抑制同源mRNA的表達(dá);Novina C D等證實(shí)無(wú)論是針對(duì)病毒感染細(xì)胞所需的CD4受體，還是針對(duì)病毒基因組的gag區(qū)域，siRNA都可以有效地使病毒與細(xì)胞的基因沉默，抑制HIV的感染與復(fù)制。

 

1.2 RNAi的作用特點(diǎn)

 (1)“共抑制”性。RNAi是雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，它的啟動(dòng)子相當(dāng)活躍，外源基因可以轉(zhuǎn)錄，但不能正常積累mRNA；RNAi作用不僅使外源基因在轉(zhuǎn)錄后水平上失活，同時(shí)誘導(dǎo)與其同源的內(nèi)源基因沉默。
(2) 高效性。試驗(yàn)證明雙鏈RNA干擾mRNA 翻譯的效率比單純反義或正義RNA 的抑制效率提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)；RNAi可在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度 下，使靶基因表達(dá)降到很低水平甚至完全“剔除”，而產(chǎn)生缺失突變體表型。它比基因敲除技術(shù)更為便捷，科學(xué)家稱RNAi技術(shù)為靶基因或靶蛋白的“剔降 ”(knockdown)。

 (3)高特異性。由dsRNA降解成的小干擾RNA，除其正義鏈3′端的兩個(gè)堿基在序列識(shí)別中不起主要作用外， 其余堿基在序列識(shí)別中都是必需的，單個(gè)堿基的改變即可使RNAi失效，RNAi能特異性降解mRNA，針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則可使同源基因全部失活。

(4)高穿透性。RNAi具有很強(qiáng)的穿透能力，能在不同的細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持，如在含有雙鏈RNA的溶液中，喂食表達(dá)雙鏈RNA的細(xì)菌等，能向秀麗隱桿線蟲(chóng)導(dǎo)入雙鏈RNA。

(5)“遺傳性”。已在線蟲(chóng)中觀察到RNAi效應(yīng)通過(guò)生殖系傳遞到后代，說(shuō)明RNAi具有一定的可遺傳性。

(6)高穩(wěn)定性。細(xì)胞中可能存在天然的穩(wěn)定siRNA的機(jī)制。此機(jī)制可能是siRNA與某種保護(hù)性蛋白結(jié)合，從而使其具有相對(duì)的穩(wěn)定性，這些雙鏈RNA 不像反義核酸那樣需要多種化學(xué)修飾來(lái)提高其半衰期。

(7) 雙干擾系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物中存在有非特異性干擾和特異性干擾兩條獨(dú)立的途徑。 非特異性干擾反應(yīng)是由大于30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA介導(dǎo)，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞中非特異 性蛋白合成抑制，RNA降解；特異性反應(yīng)由21 bp～25 bp的小干擾RNA介導(dǎo)，可逃避非特異性干擾系統(tǒng)的“監(jiān)控”，只降解與其序列相應(yīng)的單個(gè)基因 的mRNA。

2 研究方法

在研究過(guò)程中，科研人員逐漸摸索總結(jié)出了成套的研究 方法。目前，展開(kāi)RNAi操作主要有兩種方法。一種為直接將靶向特定基因的大約21個(gè)堿基長(zhǎng)短siRNA，或45個(gè)~50個(gè)堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA（small hairpin RNA，shRNA）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，shRNA在細(xì)胞中會(huì)自動(dòng)被加工成siRNA，從而引發(fā)基因沉默或表達(dá)抑制。另一 種為構(gòu)建特定的siRNA表達(dá)載體，通過(guò)質(zhì)粒在體內(nèi)表達(dá)siRNA而引發(fā)基因沉默。此法的優(yōu)點(diǎn)是排除了RNA酶干擾，延長(zhǎng)siRNA半衰期。更重要的是， 該法可以進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，且隨著質(zhì)粒復(fù)制擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體，基因抑制效果可傳代。試驗(yàn)表明，可被化學(xué)合成或體外合成的siRNA抑制的基因同樣可 被表達(dá)相同序列的載體表達(dá)出的siRNA所抑制。

3 RNAi的應(yīng)用

3.1 基因功能研究

在 神經(jīng)生物學(xué)研究中，科學(xué)家們通過(guò)siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)中腦腹側(cè)神經(jīng)細(xì)胞中的多巴胺能相關(guān)基因進(jìn)行了有效抑制，還通過(guò)病毒介導(dǎo)的RNAi建立了此類成年小鼠 模型，不僅為建立神經(jīng)系統(tǒng)的功能缺失模型找到了一些有價(jià)值的表型標(biāo)記，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療也有一定借鑒意義；在癌癥研究中，通過(guò)shRNA表達(dá)載體成功 抑制成年大鼠腦癌基因，同時(shí)對(duì)RNAi的遠(yuǎn)程（穿過(guò)血腦屏障）基因沉默方法進(jìn)行了非常有益的探索；利用細(xì)胞凋亡途徑，通過(guò)RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率，并發(fā)現(xiàn)Caspase 8 siRNA 處理對(duì)特異性Fas激活劑 （Jo2和AdFasL）和野生型腺病毒介導(dǎo)的急性肝功能衰竭都有效，表明這個(gè)動(dòng)物模型能反應(yīng)人類急性病毒肝炎多分子參與的機(jī)制，增強(qiáng)了siRNA用于急 性肝炎病人治療的希望。除了對(duì)某些關(guān)鍵基因的RNAi研究外，還在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們建立了一個(gè)包含8 000多個(gè)基因的siRNA表達(dá)框文庫(kù)陣列，通過(guò)它來(lái)高通量篩選NF-kB信號(hào)途徑中已知的及Unique基因。 由此可見(jiàn)，RNA干擾也正作為篩選成百甚至上千基因的工具，發(fā)揮著越來(lái)越大的作用。RNAi為系統(tǒng)地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相對(duì)簡(jiǎn)便 的途徑。通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)一個(gè)基因RNA信號(hào)的抑制，研究者可以深入研究基因功能，進(jìn)而描繪支配從細(xì)胞形態(tài)到信號(hào)系統(tǒng)的遺傳網(wǎng)絡(luò)。

3.2 基因治療及藥物篩選探索

由于RNAi是針對(duì)轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除，整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開(kāi)辟了新的途徑。 其總體思路是通過(guò)加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。尤其針對(duì)引起一些對(duì)人類健康嚴(yán)重危害的病 毒，如2003年在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行的SARS，病原體是單鏈核酸的新型冠狀病毒，尋找藥物靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)核酸藥物就更為方便。目前已經(jīng)有很多公司在積 極開(kāi)發(fā)這方面的藥物，如在SARS藥物研究中一鳴驚人的美國(guó)俄勒岡州的AVI BioPharma生物制藥公司等。國(guó)內(nèi)也有很多研究機(jī)構(gòu)及生物技術(shù)公司投 入了這方面的工作。如上海生科院成立了SARS防治科研攻關(guān)小組，其中生化細(xì)胞所和藥物所的一些課題組在從RNAi的角度努力。此外，北京大學(xué)、中南大 學(xué)，北京動(dòng)物所等大專院校和研究機(jī)構(gòu)，以及北京金賽獅反義核酸技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司等，也開(kāi)展了RNAi藥物的研究與開(kāi)發(fā)。

 

基因治療方面最引人注目的進(jìn)展之一是對(duì)肝炎病毒的RNAi研究。Mccaffrey A P等通過(guò)表達(dá)shRNA的載體在細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒后免疫 活性缺失的小鼠肝臟中成功抑制了HBV復(fù)制。與對(duì)照相比，小鼠血清中測(cè)得的HBsAg下降了84.5％，免疫組化對(duì)HBcAg的分析結(jié)果下降率更超過(guò) 99%。哈佛大學(xué)Lieberman研究小組通過(guò)注射針對(duì)Fas的siRNA，過(guò)度激活炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞自身混亂。然后給測(cè)試小鼠注入 Fas  hyperdrive 的抗體，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行siRNA處理的對(duì)照組小鼠在幾天中死于急性肝功能衰竭，而82%的siRNA處理小鼠都存活下來(lái)， 其中80%~90％的肝細(xì)胞結(jié)合了siRNA。并且，RNAi發(fā)揮功能達(dá)10 d，3周后才完全衰退。由于Fas很少在肝細(xì)胞外的其他細(xì)胞高水平表達(dá)，它 對(duì)其他器官幾乎沒(méi)有副作用。此外，這個(gè)小組還和其他研究者積極開(kāi)展針對(duì)HIV的RNAi測(cè)試，目前報(bào)道他們使用的針對(duì)CCR5蛋白的siRNA能阻止 HIV進(jìn)入免疫細(xì)胞約3周，在已經(jīng)感染的細(xì)胞中也能阻止感染病毒的復(fù)制。

然而，盡管取得了不少研究成果，但要真正用于醫(yī)療還需時(shí)日。目前大多 數(shù)還停留在小鼠測(cè)試階段，siRNA的導(dǎo)入多采用靜脈或腹腔注射，尾部注射，細(xì)胞移植等，如何對(duì)人進(jìn)行有效的給藥，既能確保藥效在靶器官靶組織有效釋放， 還要具有高度安全性等問(wèn)題都需進(jìn)一步研究。人們期待著RNAi引領(lǐng)的新醫(yī)學(xué)革命的到來(lái)。

在藥物篩選領(lǐng)域，除了線蟲(chóng)這種低等動(dòng)物的RNAi高通 量藥篩模式外，Lavery K S等對(duì)RNAi在藥篩領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了高度評(píng)價(jià)，RNAi技術(shù)將逐漸成為藥物靶點(diǎn)篩選和鑒定的強(qiáng)大工具。他對(duì)如何在 藥篩的各個(gè)階段應(yīng)用RNAi做了具體描述及展望，并指出將這項(xiàng)技術(shù)與高通量篩選、體外生物檢測(cè)和體內(nèi)疾病模式相結(jié)合，將提供大量基因功能方面的有用信息， 在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程的多個(gè)階段促進(jìn)靶點(diǎn)的有效篩選。

3.3 抗腫瘤治療

多種癌基因可以作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng) siRNA。Brummelkamp T R等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將siRNA 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，特異性抑制了癌基因 K2RAS (V12)的表達(dá)。對(duì)急性髓性白血病的研究已經(jīng)取得了較好的結(jié)果。

 

Scherr M等以引起慢性髓性白血病和bcr2abl陽(yáng)性急性 成淋巴細(xì)胞白血病的bcr2abl癌基因?yàn)榘谢�因，設(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)的siRNA，并獲得了87% 的有效抑制率。Wilda M等用siRNA抑制白 血病BCR/ABL融合基因表達(dá)也取得了成功。 因此，基于RNAi 技術(shù)的抗腫瘤治療藥物開(kāi)發(fā)潛力巨大。有報(bào)道稱，一種全新生物工程藥品“RNA干擾劑 ”(非干擾素)業(yè)已浮出水面，并有望在3年內(nèi)上市。經(jīng)過(guò)多年的探索，科學(xué)家終于發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞和病毒RNA的22對(duì)堿基中有1對(duì)堿基專門(mén)負(fù)責(zé)復(fù)制工作，只 要能使這對(duì)堿基“休眠”，癌細(xì)胞或病毒就會(huì)自動(dòng)停止復(fù)制。這一重要發(fā)現(xiàn)為一種全新藥物——RNA干擾劑奠定了基礎(chǔ)�？茖W(xué)家們相信，艾滋病、乙型肝炎、惡性 膠質(zhì)瘤(惡性腦瘤)和胰腺癌等疾病有望成為RNA干擾劑的第一批受益者(2004年經(jīng)FDA批準(zhǔn)已開(kāi)始RNA干擾劑的臨床試驗(yàn))，艾滋病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變疾病如多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病、帕金森病等將成為第二批受益者。

3.4 抗病毒治療

由 于RNAi 是機(jī)體中古老而天然的抗病毒機(jī)制，目前國(guó)外科技人員利用此特點(diǎn)，已設(shè)計(jì)出針對(duì)HIV gag、tat、rev、nef等基因的siRNA，針 對(duì)丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5B基因的siRNA，針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白和多聚酶基因的siRNA，針對(duì)口蹄疫病毒3D片段siRNA等，均 在試驗(yàn)中取得理想結(jié)果。陸續(xù)有關(guān)通過(guò)RNAi抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的報(bào)道如呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等，國(guó) 內(nèi)也已設(shè)計(jì)出針對(duì)口蹄疫病毒VP1基因的siRNA，針對(duì)丙型肝炎病毒5′保守區(qū)的siRNA，針對(duì)口蹄疫病毒IRES和L串聯(lián)序列兩側(cè)的保守區(qū)的 siRNA，針對(duì)SARS冠狀病毒的6個(gè)siRNA，即RL001、R L002、RL003、RL004、RL005和RL006，均已取得理 想結(jié)果。針對(duì)病原的siRNA已經(jīng)進(jìn)行到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，向病毒病的有效防治邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。由此可見(jiàn)，利用RNAi技術(shù)將使病毒病的有效治療成 為可能。

3.5 轉(zhuǎn)基因研究

在動(dòng)植物的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中， 經(jīng)常發(fā)生基因沉默。因此， 對(duì)轉(zhuǎn)基因沉默機(jī)制的探索可以為在轉(zhuǎn)基因研究中避免基因沉默提供對(duì)策。在轉(zhuǎn)基因植物研究中避免基因沉默可提高試驗(yàn)成功率，且節(jié)省時(shí)間，而在大型動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中避免基因沉默可節(jié)約成本，提高產(chǎn)率。

 

3.6 干細(xì)胞研究

在干細(xì)胞研究方面，在dsRNA阻斷大鼠骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞 Hes5表達(dá)的試驗(yàn)中，觀察外源性短dsRNA在轉(zhuǎn)錄后水平mRNA水平降低基因表達(dá)的效率，并對(duì)其影響因素進(jìn)行了初步探討。同時(shí)基于干細(xì)胞可能擁有自己的一套基因組，不同類型的干細(xì)胞又擁有各自所特有的基因，這些基因可能是決定干細(xì)胞特性的最關(guān)鍵的實(shí)質(zhì)性因素。因此，RNAi技術(shù)在此領(lǐng)域應(yīng)用空間廣闊。

3.7 研究信號(hào)傳導(dǎo)的新途徑

Biotech 認(rèn)為，聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅 細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑，取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果。RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中重組 蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染率不高的缺點(diǎn)，因此認(rèn)為RNAi技術(shù)可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。

3.8 常見(jiàn)病的治療

Nature 雜志報(bào)道了miRNA（Micro RNA）的應(yīng)用上一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)，成功采用miRNA調(diào)節(jié)了胰島素的分泌，這為糖尿病的治療帶來(lái)新的希望，也將為糖尿病 的新藥研究帶來(lái)新的曙光和思路。據(jù)Sicence雜志報(bào)道，顯示應(yīng)用RNAi技術(shù)可有效降低血管內(nèi)膽固醇含量，對(duì)治療心血管疾病有明顯的作用。

4 展望

綜 上所述，RNAi技術(shù)在基因功能研究、抗腫瘤治療、抗病毒治療、基因應(yīng)用研究、常見(jiàn)病的治療等許多方面都是強(qiáng)有力的工具和手段。同時(shí)做為新興的生物技術(shù)， 還有廣闊的研究和應(yīng)用空間期待著科研人員的探索。例如，siRNA在病毒持續(xù)性感染過(guò)程中扮演怎樣的角色？siRNA在冬眠動(dòng)物體內(nèi)的作用如何？RNAi 在雀斑形成中起到怎樣的作用？如上述問(wèn)題得到解決，將進(jìn)一步依據(jù)其機(jī)理及特點(diǎn)，有望應(yīng)用于病毒持續(xù)性感染的鑒別診斷及治療，利用siRNA在冬眠動(dòng)物體內(nèi) 的作用進(jìn)行星際航行，以解決能量供應(yīng)及時(shí)間躍遷問(wèn)題，RNAi應(yīng)用于祛除雀斑等。

盡管在RNAi方面的研究已取得許多突破性進(jìn)展，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的研究的報(bào)道逐漸增多，但由于RNAi機(jī)制尚未完全闡明，仍有許多問(wèn)題尚未得到徹底解答。例如，siRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制 mRNA表達(dá)是有效的， 但達(dá)不到果蠅細(xì)胞那樣的高抑制率， 可能是因?yàn)樯�物進(jìn)化水平越高，調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的復(fù)雜程度相應(yīng)的越高，多種抑制機(jī)制間相互作 用的頻率也越高，抑制作用受到的影響因素也就越多。另外， 在哺乳動(dòng)物中，RNAi能否成功地抑制基因表達(dá)以及抑制的程度還取決于細(xì)胞類型。對(duì)線蟲(chóng)來(lái)說(shuō)， 可以采用注射、浸泡或喂食的方法轉(zhuǎn)入dsRNA，而對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，尋找高效的方式來(lái)轉(zhuǎn)入siRNA以及快速的方式來(lái)篩選siRNA仍在進(jìn)一步探索中。RNAi在抗病毒感染中的應(yīng)用令人鼓舞， 但要取得最終的成功還有很漫長(zhǎng)的路要走。其中一個(gè)關(guān)鍵的原因是siRNA并不能對(duì)所有病毒RNA發(fā)生作用，有些 病毒靶序列可能隱藏在二級(jí)結(jié)構(gòu)下， 或者位于高度折疊的區(qū)域中， 而有些病毒序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物， 阻礙了與siRNA 的識(shí)別。因此，不僅要選合適的靶序列，而且需要反復(fù)試驗(yàn)。另一個(gè)重要的原因是病毒子代的突變率較高， 這使病毒可逃避siRNA 的識(shí)別。為了克服這個(gè)障礙，所選病毒 RNA的靶序列必須是高度保守的， 或者設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)siRNA同時(shí)作用。

總之，RNAi作為一種新發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，不可避免地會(huì)存在潛在的問(wèn)題，這就要求研究者在利用該技術(shù)時(shí)要考慮到生物安全性等諸多問(wèn)題，以使RNAi技術(shù)更好地為人類服務(wù)。