熒光原位雜交及其在人類基因組研究中的應(yīng)用

熒光標(biāo)記的染色體原位雜交技術(shù)提供了一種快速而有效的手段，將DNA片斷和特定的真核生物細(xì)胞的染色體區(qū)帶聯(lián)系了起來，并將這些DNA片斷排序，這是研究 DNA順序在染色體上位置的最直接的方法。最早，人們根據(jù)Gall和Pardue在1969年的工作，于70年代，建立起了同位素原位雜交技術(shù)，但當(dāng)時只 是用于DNA順序在多線染色體上的定位或是重復(fù)順序在中期染色體上的定位。1981年，Gerhard和Harper等首先證明有可能將從個體基因中得到 的單拷貝順序（SCP，single copy probe）通過同位素原位雜交技術(shù)定位到中期染色體上。在此基礎(chǔ)上，80年代初起，熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)開始起步并得到運用且不斷地發(fā)展。
 
1. FISH技術(shù)簡介
 
FISH技術(shù)包括下列幾個步驟：a.探針的準(zhǔn)備和標(biāo)記；b.探針和染色體的雜交；c.信號檢測；d.雜交信號與分帶染色體的比較

 

1.1    探針的準(zhǔn)備

 

探針的標(biāo)記有兩種。直接標(biāo)記是將熒光分子直接滲入到探針分子中，以前這種方法用的不多，由于有北京少的優(yōu)點，近來在一些公司的試劑盒中得到應(yīng)用。

 

常用的間接法是將一些類似于半抗原（hapten）的標(biāo)記分子滲入探針分子中，用的較多的試劑有生物素，地高辛（digoxigenin），二硝基苯（dinitrophenyl，DNP），汞和磺酸鹽（sulfonate）。

就摻入方式來說，生物素，地高辛等是以核苷酸衍生物的形式摻入的，可用切口平移法來進(jìn)行的，現(xiàn)在更多的人開始用隨機(jī)引物法，用這兩種方法標(biāo)記好的探針大小在 200-500bp范圍內(nèi)，是用于雜交的最佳大小。另外，也可以在已知順序的兩個引物之間用PCR法來擴(kuò)增，或從合適的載體上通過RNA轉(zhuǎn)錄而來。

1.2探針和染色體的雜交

最佳雜交條件取決于探針和目標(biāo)的性質(zhì)。已標(biāo)記好的變性的探針（200－500bp）與變性的染色體在含有甲酸胺，鹽和硫酸葡萄聚糖的雜交緩沖液中雜交過夜接著是柔和的洗滌，以去除未雜交或錯配對的探針。

1.3信號的檢測

在洗去未雜交和錯配對的探針分子之后，載片培養(yǎng)在免疫熒光試劑中，使其在探針雜交的位置上產(chǎn)生熒光信號，偶聯(lián)了熒光素分子的抗生物素蛋白被用來標(biāo)記已摻入到探針分子中的生物素。地谷新，二硝基苯，AFF和硫磺酸鹽則可以用相應(yīng)地標(biāo)上了熒光素地抗免疫球蛋白來標(biāo)記。
 最常用地?zé)晒馑胤肿佑蠪ITC，rrhodamine和Texas Red等。

1.4分帶和信號定位

染 色體地分帶可以在雜交前，也可以在雜交后。高分辨的染色體標(biāo)本是取得最好的帶形的基礎(chǔ)。常用的分帶方法有G（giemsa）帶、 Q（quinacrine）帶、R（reverse）帶，包括色霉素chromomycin A3/偏端霉素distamycin A法；hoechst33258/propidium iodide[3，8-二氨基-5-[3-（二乙基-甲基氨）丙基]6－苯菲碘]法；DAPI[DAPI：4，6-diamidino-2- phenylindole 2HCl]/propidium lodide法，染色體的分帶也可以直接用Alu LIHs(LI homo sapiens)或Alu之間的順序和染色體雜交而得到類似R帶的條帶。更多的人在努力使雜交信號和分帶可以同時在顯微鏡下看到。

由于雜交和分帶同時進(jìn)行效果不佳，有人采用FL（fractional length）來測量。以雜交信號相對于某固定位置（如端粒）的長度占該染色體長度的比例來表示。

在不分帶的情況下，特定的染色體可以通過著絲粒特異，或端粒特異的探針進(jìn)行共雜交來確定。復(fù)雜的探針族，如從一個染色體特異的DNA文庫中得來克隆，可以用來修飾和確認(rèn)染色體，稱為染色體繪圖。

影響雜交結(jié)果的參數(shù)有下列幾個：探針濃度，雜交時間，探針大小，雜交溫度，染色質(zhì)變性條件染色體得制備和硬化程度，Rnase作用條件，用于降低背景的非特 異性競爭DNA和醋酸酐處理，具體地講是DNA探針的純度；用于雜交反應(yīng)的探針的大小，小心掌握好這些條件，我們就能得到?jīng)]有熒光背景的特異信號。

FISH 的結(jié)果還有一個重要的方面，就是分辨率的問題。影響結(jié)果分辨率的因素有兩個，染色體上的特異位置和染色體的濃縮程度。著絲粒和端粒的變化比其他的染色體位 置的變化要多，在分析結(jié)果時就比較容易辨認(rèn)。特定的染色體結(jié)構(gòu)在其雜交結(jié)果的分辨率上起著重要的作用。制備染色體比較伸展?fàn)顟B(tài)的展片，如早中期染色體或中 期染色體，將會得到較高的分辨率。另外，光學(xué)系統(tǒng)的進(jìn)步也是提高分辨率的有效手段。

 

2.FISH技術(shù)的特點
 
FISH技術(shù)和同位素原位雜交相比，有著許多的優(yōu)點。

 

首先，從探針的制備雜交來看，生物素和其他標(biāo)記分子沒有放射性，標(biāo)記過程和雜交過程沒有污染的危險，比較安全。且用生物素或其他的標(biāo)記分子標(biāo)記好以后的探針分子 相當(dāng)穩(wěn)定，沒有半衰期的限制，可以長期保存。熒光顯色時間短，不像同位素雜交要求長時間曝光。背景簡單，靈敏度也不遜色。另外，F(xiàn)ISH可以用多種顏色同 時顯色。這是同位素雜交不可比擬的。這種多色作圖，可以使染色體分帶和探針信號不同的顏色而同時觀察；也可以用不同熒光標(biāo)記不同的探針，以確定探針在染色 體上的相對位置。

間期核作圖也是FISH的一個特色，因為它常常核多色技術(shù)結(jié)合在一起。中期染色體的FISH的分辨率大約為1Mb，而間期核 作圖的精度為50kb。這一精度的變化使FISH有可能直接用于基因作圖�？梢运烽g期核作圖技術(shù)是遺傳研究和脈沖電泳結(jié)果的橋梁。與遺傳圖譜不同，它不依 靠多態(tài)性指標(biāo)和大的家系；也不像脈沖電泳后的稀切點酶物理圖譜分析，它不依靠稀切點的存在和甲基化程度，并且不受CpG島出現(xiàn)頻率的影響。它的原理是間期 核上DNA順序間的距離與線性DNA分子上該兩個順序間的距離呈對應(yīng)的線性關(guān)系。由于這些原因間期核作圖可以作為遺傳作圖核物理作圖分析的輔助結(jié)果構(gòu)建染 色體亞區(qū)的基因圖。間期細(xì)胞原位雜交還可用于不能制備中期染色體的細(xì)胞的研究，如腫瘤細(xì)胞核非周期細(xì)胞。

信號擴(kuò)增也是FISH所特有的。為了 使雜交信號足夠強(qiáng)，可以進(jìn)行信號擴(kuò)增。擴(kuò)增的方法是加上一層熒光標(biāo)記的標(biāo)記分子的抗體，再加上一層偶聯(lián)了標(biāo)記分子的抗體，然后再加上一層熒光標(biāo)記的標(biāo)記分 子的抗體，形成三明治結(jié)構(gòu)。以生物素標(biāo)記為例，在加熒光標(biāo)記的抗體生物素蛋白avidin之后，加一層山羊生物素標(biāo)記抗-抗生物素D，然后再加上一層熒光 標(biāo)記的抗生物素蛋白。

用于人染色體作圖的典型探針是cDNA或克隆的基因組DNA片段，大多數(shù)cDNA由單拷貝順序組成，SCP由單拷貝的基因組順序組成。而大多數(shù)的克隆基 因片段中除了單拷貝順序外還有插入重復(fù)順序（interspersed repeatitive sequence，IRS），如Alu，據(jù)分析每3－5kb就有一個Alu順序，所以在用cos質(zhì)粒核YAC（yeast artificial chromosone，酵母人工染色體）作為探針時，就會有一些重復(fù)順序干擾單一順序產(chǎn)生特異性信號。通常將標(biāo)記好的探針片段變性，與過量的非標(biāo)記的競爭 DNA一起復(fù)性，常用的有人總DNA或Cot1DNA。這是探針中的IRS就很快地與競爭DNA中地IRS結(jié)合，剩下的是已標(biāo)記了單拷貝順序，所看到的染 色體上的雜交信號就表明了單拷貝順序所在的位置，這一過程在FISH中叫做抑制性雜交。抑制性雜交的使用使FISH的應(yīng)用更加廣泛，并可能在人類基因組的研究中發(fā)揮其作用。
 
3.FISH在人類基因組研究中的應(yīng)用
 
FISH作為確定基因片段在染色體上位置最直接的方法，在人類基因組研究中的應(yīng)用日益廣泛深入。所研究的基因片段通�？寺≡谫|(zhì)粒，phage，cosmid核YAC中，可以用FISH技術(shù)知道其在分帶染色體上的位置，也可以以次手段進(jìn)行某種遺傳病的診斷。

3. 1 SCP（single copy probe）的定位

SCP的定位是染色體骨架圖構(gòu)建的主要內(nèi)容之一當(dāng)SCP用生物素標(biāo)記之后，與中期染色體雜交，用免疫熒光標(biāo)記的試劑檢測，就可以明確地知道某個SCP在做好分帶的中期染色體上的位置。SCP的定位是應(yīng)用FISH技術(shù)進(jìn)行人類基因組研究中的最簡單的一種。但是太小的片段在實際工作的難度較大。FISH不僅可以使SCP可以直接定位于染色體上，也可以定位于間期核，為高分辨率的基因作圖和核組織分析提供了有力的手段。

3. 2 Cos質(zhì)粒的定位

cos質(zhì)粒的克隆容量約為35－45kb，在FISH剛開始應(yīng)用時這個大小是很適合于做探針的，在使用抑制性雜交之前是先分離cos質(zhì)粒的插入片段中的單拷貝順序，然后才進(jìn)行雜交。應(yīng)用了抑制性雜交步驟之后一切就方便多了。1992年Fan報道了他們將50個cos質(zhì)�？寺∮� FISH定位到了染色體上的結(jié)果。其中38個在X染色體上分布于長臂或短臂上，另外10個分布于中心粒上。這些結(jié)果促進(jìn)了X染色體的作圖，同時分布于X和 8號染色體中心粒上的那些cos質(zhì)粒，將有利于這些區(qū)域的結(jié)果和組成的研究。1990年，Lichter等人報道，運用數(shù)字圖像技術(shù)分析cos質(zhì)粒為探針 的FISH結(jié)果，所用的染色體是早中期染色體，結(jié)果和雜交細(xì)胞株系列的結(jié)果一致。當(dāng)3個或3個以上的cos質(zhì)粒同時雜交時，可以得出它們在染色體上的順 序。1991年，Trask報道，將2個或3個cos質(zhì)粒經(jīng)兩種不同顏色的熒光標(biāo)記之后，與間期核進(jìn)行雜交，由此排出了7個cos質(zhì)粒的順序，精度在 50kb。

3.3 YAC的定位核YAC重疊群（contin的構(gòu)建

YAC的容量比起cos質(zhì)粒來就更大了，最大的可達(dá) 1～2Mb。定位YAC的方法有三種。有些探針在染色體上的位置已知（可以用FISH來定位），而又可以肯定它在某個YAC中，那么這個YAC在染色體上 的位置就確定了。YAC也可以直接進(jìn)行FISH。先抽提酵母的DNA，然后脈沖電泳分離出YAC的插入片段，用此插入片段進(jìn)行FISH；現(xiàn)在PCR技術(shù)越 來越成熟，可以用Alu PCR法擴(kuò)增YAC的插入部分，將Alu PCR產(chǎn)物來進(jìn)行FISH。在多個YAC分別定位的基礎(chǔ)上，或根據(jù)幾個YAC經(jīng)過多色標(biāo)記后同時與染色體雜交后的結(jié)果，可以按YAC間的相對位置來構(gòu)建 YAC重疊群。所得的結(jié)果可通過一個YAC經(jīng)標(biāo)記后與YAC庫內(nèi)的其他YAC進(jìn)行雜交的結(jié)果來驗證。1991年Montanaro報道，他們用FISH的 方法定位了102個YAC。這些YAC覆蓋了Xq24－Xq28的50％的區(qū)域。他們定位的精度是0.5帶，所以這102個YAC就分布在9個區(qū)段內(nèi)（半 條帶為一個區(qū)段）。這些結(jié)果綜合起來為YAC重疊群的構(gòu)建提供了一條道路。