用ETD線性離子阱質(zhì)譜成功鑒定蛋白和翻譯后修飾

 

在翻譯后修飾和/或極堿肽的序列分析方面，電子轉(zhuǎn)移裂解（ ETD ）線性離子阱質(zhì)譜是很有優(yōu)勢(shì)的工具。傳統(tǒng)的誘導(dǎo)活化裂解（CAD）常用來(lái)鑒定蛋白，并試圖確定和找到他們修飾的位點(diǎn)，但這種技術(shù)有其本身固有的缺點(diǎn)，下面將詳細(xì)敘述。與線性離子阱的結(jié)合使用的ETD是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)可靠的技術(shù)，可以很容易鑒定用CAD不能鑒定的多肽。ETD 是一個(gè)相對(duì)較新的肽/蛋白質(zhì)碎裂的技術(shù)，能夠大大推進(jìn)質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)這個(gè)領(lǐng)域的進(jìn)步。

 

翻譯后修飾（PTM）是翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行的一種化學(xué)修飾，是蛋白質(zhì)生物合成的后續(xù)步驟之一。蛋白的分析及其翻譯后修飾的分析對(duì)于研究許多疾病是非常重要的，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病---阿爾茨海默病。這是因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)的合成的過(guò)程中以及合成之后，可能發(fā)生各種蛋白修飾。對(duì)于正常細(xì)胞的功能，這些修飾是必須的，但調(diào)節(jié)這些修飾的變化可能會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默病，癌癥和勃起功能障礙。蛋白質(zhì)修飾可提高/降低蛋白質(zhì)的活性，可以與其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用和將某一蛋白質(zhì)定位到細(xì)胞的特定地方。

 

翻譯后修飾，如磷酸化，乙�；�和甲基化被用作化學(xué)開(kāi)關(guān)，激活/滅活組蛋白基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控， DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)。組蛋白是染色質(zhì)的主要蛋白，DNA盤(pán)繞時(shí)，它們起到線軸的作用，而且在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此，鑒定這種翻譯后修飾是必需的，因?yàn)樗�在生物系統(tǒng)中對(duì)于某些蛋白的功能和作用至關(guān)重要。

 

 

質(zhì)譜在確定蛋白及其翻譯后修飾上發(fā)揮了不可或缺的作用。CAD是一種常見(jiàn)的分析鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。一般用胰蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成較小的多肽，然后用反相色譜將其分離，并直接注入電噴霧質(zhì)譜儀檢測(cè)，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜（ MS / MS法）獲得序列信息。通過(guò)電噴霧電離這些多肽形成幾種帶電狀態(tài)的肽離子，而較低帶電狀態(tài)的最適合CAD分析。低能量的CAD串聯(lián)質(zhì)譜一直是最常用的分析方法，通過(guò)裂解肽離子進(jìn)行后續(xù)的序列分析。

翻譯后修飾分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很難用CAD進(jìn)行分析，因?yàn)檫@些修飾通常是不穩(wěn)定且容易丟失肽骨架的碎裂信息，從而導(dǎo)致很少或幾乎不能得到肽序列和磷酸化位點(diǎn)。利用常規(guī)的CAD質(zhì)譜對(duì)于含多個(gè)堿性殘基多肽測(cè)序也是極為困難。

根據(jù)不同的蛋白質(zhì)序列，有時(shí)胰蛋白酶會(huì)產(chǎn)生過(guò)小或過(guò)大的肽段。在這種情況下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD對(duì)短的，低帶電的多肽是最有效的。對(duì)于鑒定蛋白和了解蛋白的生物學(xué)功能，這是一種廣泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，這也阻止多個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)的檢測(cè)和了解這些蛋白的生物學(xué)功能。

 

ETD是基于離子/離子氣相化學(xué)一種碎裂多肽的新方法。ETD通過(guò)從陰離子自由基到質(zhì)子肽轉(zhuǎn)移電子的化學(xué)能量將肽碎裂，這引起多肽骨干的分裂。 ETD產(chǎn)生的骨干肽序列和肽側(cè)鏈的信息往往與CAD互補(bǔ)。

ETD已成功應(yīng)用與線性離子阱以及其前身三維離子阱。雖然ETD在三維阱的執(zhí)行價(jià)格具有競(jìng)爭(zhēng)力且和CAD自身相比提供了獨(dú)特好處 ，這樣的組合并沒(méi)有提供蛋白質(zhì)組學(xué)分析所需的技術(shù)能力。非線性離子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解過(guò)程，而且由于三維阱離子存儲(chǔ)能力的有限不能處理大量的多肽�；�于此，研究人員已經(jīng)提出ETD功能應(yīng)用于線性離子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer質(zhì)譜儀） 。

相對(duì)于傳統(tǒng)的CAD技術(shù)， ETD提供了更穩(wěn)定的方法來(lái)定性PTMs，鑒定大型多肽或甚至整個(gè)蛋白質(zhì)。 ETD能夠?qū)⑵胀ǚ�譯后修飾的多肽，或者多個(gè)堿性殘基的多肽甚至整個(gè)蛋白質(zhì)生成離子。 ETD也可以輕易碎裂含有二硫鍵的的多肽。

 

ETD是為更復(fù)雜的FT-ICR儀器開(kāi)發(fā)相似的裂解技術(shù)。使用電子轉(zhuǎn)移試劑，而不是影響肽碎裂的自由電子使ETD在廣泛使用的射頻四極離子阱中得到應(yīng)用。射頻離子阱質(zhì)譜儀具有低成本，低維護(hù)費(fèi)用以及更易接受優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)于CAD碎裂方法，ETD碎裂技術(shù)能夠產(chǎn)生更多的產(chǎn)物離子，利于肽段的解讀。

ETD的線性離子阱提供了強(qiáng)有力的工具鑒定蛋白及其翻譯后修飾 。LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀比其他任何離子阱提供更多的結(jié)構(gòu)信息，ETD能夠得到常規(guī)方法無(wú)法得到的序列信息。相比非線性離子阱，ETD的線性離子阱的顯著特征在于離子和離子發(fā)生反應(yīng)。雖然ETD功能是完全自動(dòng)的且通常無(wú)需用戶干預(yù)，但是當(dāng)需要對(duì)離子數(shù)進(jìn)行累積的時(shí)候，用戶可通過(guò)軟件完全控制線性離子阱的離子。線性離子阱質(zhì)譜儀有能力處理大量的樣品，并分析低濃度的大分子和小分子。與非線性離子阱的相比，該過(guò)程更為復(fù)雜和費(fèi)時(shí)

 

 

在最近的應(yīng)用中，極堿的多肽和大量重要的翻譯后修飾已經(jīng)用含CAD和ETD線性離子阱質(zhì)譜分析了。通常CAD碎裂方式產(chǎn)生的普通只顯示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂這些多肽的時(shí)候， 肽骨架碎裂信息能完全或幾乎完全產(chǎn)生，因此得到更廣泛的多肽序列的信息。

 

ETD的靈敏度和穩(wěn)定性對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解決方案，此方案具有用戶友好性，幾乎不需要日常維護(hù)，并提供高度準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，而且ETD的數(shù)據(jù)分析有相應(yīng)的軟件支持，非常方便簡(jiǎn)單。

 

結(jié)論：

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域，ETD的應(yīng)用對(duì)于研究疾病的機(jī)理，如癌癥，藥物開(kāi)發(fā)研究以及細(xì)胞功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有重大意義，ETD將擴(kuò)大目前的分析，包括更多的堿性、非胰酶切肽段和蛋白質(zhì)。它們能確定各種翻譯后修飾以及鑒定新的蛋白亞型。

 

配備ETD的線性離子阱質(zhì)譜可應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)。ETD的線性離子阱將繼續(xù)推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，而且已被證明是替代CAD一種有效技術(shù)，而且ETD同樣可以應(yīng)用于非線性離子阱進(jìn)行肽序列分析。在不久的將來(lái)，配備ETD的線性離子阱預(yù)計(jì)將成為碎裂技術(shù)的一種新選擇。

 

參考文獻(xiàn)

 

[1] Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003