高通量測(cè)序技術(shù)——第二代測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing)足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序(deep sequencing)。

自從2005年454 Life Sciences公司（2007年該公司被Roche正式收購(gòu)）推出了454 FLX焦磷酸測(cè)序平臺(tái)（454 FLX pyrosequencing platform）以來(lái)，曾推出過(guò)3730xl DNA測(cè)序儀（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）這家一直占據(jù)著測(cè)序市場(chǎng)最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開(kāi)始動(dòng)搖了，因?yàn)樗麄兊娜�頭產(chǎn)品毛細(xì)管陣列電泳測(cè)序儀系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個(gè)強(qiáng)有力的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手，一個(gè)就是羅氏公司(Roche)的454 測(cè)序儀(Roche GS FLX sequencer)，，另一個(gè)就是2006年美國(guó)Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺(tái)（Genome Analyzer platform），為此，2007年ABI公司推出了自主研發(fā)的SOLiD 測(cè)序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個(gè)測(cè)序平臺(tái)即為目前高通量測(cè)序平臺(tái)的代表。（見(jiàn)表一）

表一：主流測(cè)序平臺(tái)一覽

這些平臺(tái)共同的特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量，相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序的96道毛細(xì)管測(cè)序，高通量測(cè)序一次實(shí)驗(yàn)可以讀取40萬(wàn)到400萬(wàn)條序列。讀取長(zhǎng)度根據(jù)平臺(tái)不同從25bp到450bp，不同的測(cè)序平臺(tái)在一次實(shí)驗(yàn)中，可以讀取1G到14G不等的堿基數(shù)，這樣龐大的測(cè)序能力是傳統(tǒng)測(cè)序儀所不能比擬的。盡管如此，在這項(xiàng)新的劃時(shí)代的測(cè)序技術(shù)剛出現(xiàn)的時(shí)候，科學(xué)界對(duì)這項(xiàng)新技術(shù)卻并不熱衷。許多習(xí)慣用桑格技術(shù)的科學(xué)家懷疑新技術(shù)的準(zhǔn)確度、閱讀能力、成本消費(fèi)、實(shí)用性。代理Sanger型測(cè)序硬件的經(jīng)銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。

圖一：在芯片上進(jìn)行的測(cè)序：Illumina測(cè)序平臺(tái)

然而大多數(shù)人卻忽略了一個(gè)事實(shí)，即桑格技術(shù)的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術(shù)剛開(kāi)發(fā)出來(lái)時(shí)，閱讀能力很難超過(guò)25bp，即使在Fred Sanger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達(dá)到80bp，如今卻達(dá)到了750bp；而新發(fā)展的合成測(cè)序技術(shù)，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序方法，其閱讀能力最初只有100bp，推向市場(chǎng)16個(gè)月后增加至250bp，隨著技術(shù)的不斷完善，目前已達(dá)到了400bp，很快就接近桑格技術(shù)目前的水平。除了閱讀能力外，能否以有限的成本用一臺(tái)儀器產(chǎn)生足夠數(shù)量的序列標(biāo)記也是另一個(gè)需要改善的重要問(wèn)題。這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)被Roche公司解決了，應(yīng)用他們的系統(tǒng)，僅花費(fèi)閱讀35bp或者更小片段的成本就能產(chǎn)生比35bp多10倍的序列標(biāo)記。

       圖二：GS FLX 高通量測(cè)序方法原理示意圖

  一、高通量測(cè)序的應(yīng)用

高通量測(cè)序可以幫助研究者跨過(guò)文庫(kù)構(gòu)建這一實(shí)驗(yàn)步驟，避免了亞克隆過(guò)程中引入的偏差。 依靠后期強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，對(duì)照一個(gè)參比基因組(reference genome)高通量測(cè)序技術(shù)可以非常輕松完成基因組重測(cè)序(re-sequence)，2007年van Orsouw等人結(jié)合改進(jìn)的AFLP 技術(shù)和454 測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米基因組進(jìn)行了重測(cè)序，該重測(cè)序?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)的超過(guò)75%的SNP位點(diǎn)能夠用SNPWave技術(shù)驗(yàn)證，提供了一條對(duì)復(fù)雜基因組特別是含有高度重復(fù)序列的植物基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的技術(shù)路線。2008年Hillier對(duì)線蟲(chóng)CB4858 品系進(jìn)行Solexa重測(cè)序，尋找線蟲(chóng)基因組中的SNP位點(diǎn)和單位點(diǎn)的缺失或擴(kuò)增。但是也應(yīng)該看到，由于高通量測(cè)序讀取長(zhǎng)度的限制，使其在對(duì)未知基因組進(jìn)行從頭測(cè)序(novo sequencing)的應(yīng)用受到限制，這部分工作仍然需要傳統(tǒng)測(cè)序(讀取長(zhǎng)度達(dá)到850 堿基)的協(xié)助。但是這并不影響高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組mRNA表達(dá)譜，microRNA表達(dá)譜，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的應(yīng)用。

2008年Mortazavi等人對(duì)小鼠的大腦、肝臟和骨骼肌進(jìn)行了RNA 深度測(cè)序，這項(xiàng)工作展示了深度測(cè)序在轉(zhuǎn)錄組研究上的兩大進(jìn)展，表達(dá)計(jì)數(shù)和序列分析。對(duì)測(cè)得的每條序列進(jìn)行計(jì)數(shù)獲得每個(gè)特定轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量，是一種數(shù)碼化的表達(dá)譜檢測(cè)，能檢測(cè)到豐度非常低的轉(zhuǎn)錄本。分析測(cè)得的序列，有大于90%的數(shù)據(jù)顯示落在已知的外顯子中，而那些在已知序列之外的信息通過(guò)數(shù)據(jù)分析展示的是從未被報(bào)道過(guò)的RNA剪切形式，3’端非翻譯區(qū)，變動(dòng)的啟動(dòng)子區(qū)域以及潛在的小RNA 前體，發(fā)現(xiàn)至少有3500個(gè)基因擁有不止一種剪切形式。而這些信息無(wú)論使用芯片技術(shù)還是SAGE文庫(kù)測(cè)序都是無(wú)法被發(fā)現(xiàn)的。

高通量測(cè)序另一個(gè)被廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小分子RNA或非編碼RNA(ncRNA)研究。測(cè)序方法能輕易的解決芯片技術(shù)在檢測(cè)小分子時(shí)遇到的技術(shù)難題(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量測(cè)序的長(zhǎng)度，使得數(shù)據(jù)“不浪費(fèi)”，同時(shí)測(cè)序方法還能在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA。在衣藻、斑馬魚(yú)、果蠅、線蟲(chóng)、人和黑猩猩中都已經(jīng)成功地找到了新的小分子RNA。在線蟲(chóng)中獲得了40 萬(wàn)個(gè)序列，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)了18個(gè)新的小RNA分子和一類全新的小分子RNA。 

在DNA—蛋白質(zhì)相互作用的研究上，染色質(zhì)免疫沉淀—深度測(cè)序(ChIP-seq)實(shí)驗(yàn)也展示了其非常大的潛力。染色質(zhì)免疫沉淀以后的DNA 直接進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比ref seq可以直接獲得蛋白與DNA結(jié)合的位點(diǎn)信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以檢測(cè)更小的結(jié)合區(qū)段、未知的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的突變情況和蛋白親合力較低的區(qū)段。

      圖 三: Independent Flow Cells（SoLid^TM System）

二、高通量測(cè)序的前景

目前，大多分析家都無(wú)法相信新一代測(cè)序技術(shù)能完全取代目前的芯片測(cè)序技術(shù)。不過(guò)，有些分析家也的確認(rèn)為芯片測(cè)序技術(shù)正面臨著挑戰(zhàn)，他們認(rèn)為到了2012年新一代的測(cè)序技術(shù)將會(huì)帶來(lái)高達(dá)2。15億美元的產(chǎn)值。

2006年，整個(gè)芯片測(cè)序市場(chǎng)大概價(jià)值8億美元，其中65%的市場(chǎng)份額都是有關(guān)基因表達(dá)譜分析產(chǎn)品的，剩下35%的市場(chǎng)份額則由基因型分析芯片占據(jù)。不過(guò)美國(guó)哈佛大學(xué)（Harvard University）遺傳學(xué)教授George Church認(rèn)為，這部分市場(chǎng)也會(huì)受到新一代測(cè)序技術(shù)的沖擊。重測(cè)序芯片（resequencing arrays）、單核苷酸多態(tài)性分析芯片以及基因拷貝數(shù)目變異分析芯（copy number variant array）市場(chǎng)也會(huì)受到影響。也有分析家不贊同這個(gè)觀點(diǎn)，他們認(rèn)為即使新一代測(cè)序技術(shù)很便宜，還是有不少人會(huì)選擇傳統(tǒng)的測(cè)序儀的。

新一代測(cè)序技術(shù)相對(duì)傳統(tǒng)芯片測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，最終還得依靠廣告和市場(chǎng)營(yíng)銷手段的推廣才能獲得大眾的認(rèn)可。去年夏天，由Frost & Sullivan公司對(duì)學(xué)術(shù)科研機(jī)構(gòu)和私人研究團(tuán)體進(jìn)行的一項(xiàng)調(diào)查研究結(jié)果表明，在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，例如進(jìn)行表達(dá)譜分析時(shí)，人們還是傾向于選擇傳統(tǒng)的芯片產(chǎn)品，而并非青睞新一代的測(cè)序產(chǎn)品。

新一代測(cè)序儀推廣困難可能由其價(jià)格昂貴導(dǎo)致。平均采購(gòu)一臺(tái)新一代測(cè)序儀大約要花費(fèi)50萬(wàn)美元，除非該實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的工作量非常大，否則是不會(huì)考慮購(gòu)買(mǎi)的。即使像Polonator這樣的新一代測(cè)序儀也需要花費(fèi)15萬(wàn)美元左右，這筆費(fèi)用對(duì)于一個(gè)小實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)是無(wú)法承受的。這時(shí)，只需要150美元一塊的芯片就非常有競(jìng)爭(zhēng)力了。以基因芯片產(chǎn)品享譽(yù)業(yè)界的美國(guó)Affymetrix公司市場(chǎng)部副總裁Jay Kaufman認(rèn)為，新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)于芯片市場(chǎng)來(lái)說(shuō)的確會(huì)帶來(lái)一定的沖擊，不過(guò)要完全取代表達(dá)譜分析芯片還需要一定的時(shí)間。

但是，基因芯片也有其自身的缺點(diǎn)，就在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測(cè)人們已知序列的特征(或有限的變異)。而高通量測(cè)序的強(qiáng)項(xiàng)， 就在于它是一個(gè)“開(kāi)放系統(tǒng)”， 它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力，從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)。 研究者可以充分享受這兩個(gè)平臺(tái)的比較優(yōu)勢(shì)，在獲取新信息的基礎(chǔ)上，利用芯片的強(qiáng)項(xiàng)， 即對(duì)已知信息的高通量、低成本(相對(duì))的檢測(cè)能力， 對(duì)大量樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，短時(shí)間內(nèi)獲得有大量有效的數(shù)據(jù)。

作為兩個(gè)高通量的基因組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面存在重疊和競(jìng)爭(zhēng)，但是在更多方面是優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，兩種方法聯(lián)合使用，將解決以前的單種技術(shù)難以解決的問(wèn)題。

三、結(jié)語(yǔ)

新一代測(cè)序已顯示出巨大的潛力。也正是因?yàn)榭茖W(xué)的不斷進(jìn)步，在給測(cè)序技術(shù)提出新要求的時(shí)候，也給這項(xiàng)技術(shù)帶來(lái)了新的增長(zhǎng)點(diǎn)：

2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開(kāi)發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù)，也被稱為第三代測(cè)序技術(shù)，并利用該技術(shù)對(duì)一個(gè)M13病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序。這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測(cè)序，是因?yàn)樗�完全跨過(guò)了上述3種高通量測(cè)序依賴的基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程，真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力，向1000美元測(cè)定一個(gè)人類基因組的目標(biāo)邁出了一大步。