微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記及其應(yīng)用

微衛(wèi)星（Microsatellite，MS）又稱(chēng)短串聯(lián)重復(fù)（Short Tandem Repeats，STR）或簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple Sequnce Repeat，SSR），是指基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（多數(shù)為2-4個(gè)）為單位多次串聯(lián)重復(fù)組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列。其中最常見(jiàn)的是雙核苷酸重復(fù)，如（AC）n、（TG）n等，微衛(wèi)星DNA廣泛分布在真核生物的基因組中，大約每隔10-550kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。微衛(wèi)星DNA由于具有特異性的PCR擴(kuò)增、多態(tài)信息容量（PIC）高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。

 

 

微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性，主要表現(xiàn)在核苷酸重復(fù)單位數(shù)目的多態(tài)性和重復(fù)序列中核苷酸的替換多態(tài)性。一般認(rèn)為，一個(gè)微衛(wèi)星DNA核心序列重復(fù)數(shù)目越高，其等位基因數(shù)目也就越多，多態(tài)性就越豐富。微衛(wèi)星DNA遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，能夠穩(wěn)定地從上一代傳給下一代，且等位基因間呈現(xiàn)共顯性遺傳。除此以外，微衛(wèi)星標(biāo)記還具有DNA用量少、反應(yīng)速度快、操作簡(jiǎn)易、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn)。

根據(jù)重復(fù)結(jié)構(gòu)的不同可將微衛(wèi)星DNA分為3類(lèi)：完全重復(fù)型（perfect），單一序列單元無(wú)中斷或無(wú)顛倒；不完全重復(fù)型（imperfect），單一序列單元有中斷或有顛倒；混合型（compound），多個(gè)序列中單位有或無(wú)中斷和有或無(wú)顛倒的混合。一般說(shuō)來(lái)，微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列兩側(cè)都有物種特異性的保守序列，所以，通過(guò)設(shè)計(jì)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳（或聚丙烯酰胺凝膠電泳）和放射自顯影（或銀染），就可以檢測(cè)到在簡(jiǎn)單重復(fù)序列重復(fù)單位數(shù)不同的DNA區(qū)域的多態(tài)性，這就是微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記。

 

 

微衛(wèi)星在基因組中是均勻分布的。Winter 等人的研究表明, 除著絲粒及端粒區(qū)域外, 染色體的其他區(qū)域均廣泛分布有微衛(wèi)星位點(diǎn)。Litt 和Luty以及Weber 和May各自用熱穩(wěn)定Tag 酶的PCR 方法證明, 微衛(wèi)星具有豐富的多態(tài)性。用微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記與其他DNA分子標(biāo)記(包括RFLP、RAPD 和小衛(wèi)星DNA等) 相比具有以下優(yōu)點(diǎn)。

由于微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)相當(dāng)多，因而雜合程度高，多態(tài)信息含量（PIC）大，在區(qū)分親緣關(guān)系極近的個(gè)體（群體）時(shí)的效率比PFLP高。

由于小衛(wèi)星的等位基因一般比較大，在PCR擴(kuò)增時(shí)有一定局限性。而使用微衛(wèi)星進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其使用樣品數(shù)量少。另外，由于微衛(wèi)星序列較短，即使降解的DNA也有可能包含足夠用來(lái)擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)，這一特點(diǎn)使那些保存差的樣品也可能成為有價(jià)值的研究材料。

微衛(wèi)星DNA所在區(qū)域在生物的基因組中是比較保守的，某一物種的微衛(wèi)星引物可在相關(guān)密切的物種中使用，這使得減少獲取微衛(wèi)星的工作量和加快比較基因組作圖的工作進(jìn)度成為可能。

微衛(wèi)星DNA呈孟德?tīng)柟诧@性遺傳模式，可以區(qū)別純合顯性個(gè)體和雜合顯性個(gè)體，這為遺傳研究提供了更多的可供分析的信息。

多數(shù)SSR無(wú)功能作用，增加或減少幾個(gè)重復(fù)序列的頻率高，因而在品種間具有廣泛位點(diǎn)變異，比RFLP及RAPD分子標(biāo)記更具有多態(tài)性。

微衛(wèi)星的突變率很高，從而產(chǎn)生了很多等位基因，這就導(dǎo)致了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性，一般認(rèn)為，微衛(wèi)星豐富的多態(tài)性是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MI）的表現(xiàn)。微衛(wèi)星的突變速率在不同物種以及同一物種的不同位點(diǎn)甚至在同一位點(diǎn)的不同等位基因間都存在著很大的差異。在哺乳動(dòng)物中，大多數(shù)的微衛(wèi)星的突變率估計(jì)為每世代10^-6-10^-2人類(lèi)家系的微衛(wèi)星平均突變速率為10-⁴；黑腹果蠅受控雌性系中的突變率為每個(gè)位點(diǎn)10^-6左右。當(dāng)微衛(wèi)星被表達(dá)在缺乏有效錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的寄主中時(shí)，其不穩(wěn)定性要比正常時(shí)高（5-10）×10³左右。

微衛(wèi)星突變的遺傳學(xué)機(jī)制現(xiàn)在尚不清楚，目前大多認(rèn)為微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性或者與DNA重組過(guò)程中的不等交換有關(guān)，或者與DNA復(fù)制過(guò)程中的“滑鏈錯(cuò)配”有關(guān)。

Johnson和Pupko等認(rèn)為，兩條染色體間的DNA重組過(guò)程中發(fā)生的不等交換以及基因轉(zhuǎn)換可能是引起微衛(wèi)星多態(tài)性產(chǎn)生的主要原因。而Levinson等認(rèn)為在DNA復(fù)制合成的過(guò)程中，發(fā)生了局部解鏈，有微衛(wèi)星存在的區(qū)域新生鏈和模板鏈相對(duì)滑動(dòng)，產(chǎn)生錯(cuò)配，使得一個(gè)或者幾個(gè)重復(fù)單位形成環(huán)狀未能參與配對(duì)，從而導(dǎo)致了微衛(wèi)星多態(tài)性的產(chǎn)生。

 

 

微衛(wèi)星DNA 作為遺傳標(biāo)記具有很大的優(yōu)越性。近年來(lái)隨著研究的不斷深入,對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的研究不僅具有重要的理論意義, 而且還具有較好的應(yīng)用前景。

在自然界中,生物個(gè)體表現(xiàn)出來(lái)的各種遺傳變異,在本質(zhì)上就是DNA 的差異,因此通過(guò)研究DNA的變異來(lái)分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性更為直接。微衛(wèi)星其重復(fù)單位數(shù)量可能不完全相同,因而形成多態(tài)性,即SSR 分子標(biāo)記,這可能是由于有絲分裂過(guò)程中同源微衛(wèi)星間的不等交換或復(fù)制過(guò)程“鏈滑”(strand slippage) 作用造成的。微衛(wèi)星多態(tài)性反映著物種的進(jìn)化歷史,共有的等位基因在該物種基因組中最為古老、保守。與蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)相比較,利用微衛(wèi)星標(biāo)記估計(jì)的群體遺傳雜合度和遺傳距離明顯優(yōu)于蛋白質(zhì)多態(tài)性標(biāo)記,而且在分析遺傳關(guān)系較近的種群和品種時(shí),微衛(wèi)星標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記具有更為準(zhǔn)確的數(shù)值。

Powell 等指出微衛(wèi)星比其他分子標(biāo)記如RFLP、RAPD、AFLP 更能揭示遺傳多樣性。Scott 等根據(jù)從5000個(gè)葡萄表達(dá)序列標(biāo)簽( ESTS) 中分離的124 個(gè)微衛(wèi)星而設(shè)計(jì)的16 對(duì)SSR 引物,對(duì)7 個(gè)葡萄資源進(jìn)行分析。結(jié)果證明: 在3’非翻譯區(qū)(3’U TR) 分離的微衛(wèi)星在品種間具有較高的多態(tài)性;在5’非翻譯區(qū)(5’U TR) 分離的微衛(wèi)星在種和品種間具有較高的多態(tài)性；而在編碼區(qū)分離的微衛(wèi)星在種和屬間具有較高多態(tài)性。Fahima 等的實(shí)驗(yàn)證實(shí),單子葉植物大麥及雙子葉植物鷹嘴豆也存在串聯(lián)排列( GTAT) n和簡(jiǎn)單重復(fù)序列( GACA) n ,而且顯示出高度多態(tài)性。Plaschke 等用23 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)40 份歐洲小麥品種進(jìn)行檢測(cè),共發(fā)現(xiàn)142 個(gè)SSR多態(tài)性位點(diǎn),平均每個(gè)SSR 標(biāo)記能檢測(cè)到6.2 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。郭小平等用137 對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)2 個(gè)玉米自交系B14 和B96 進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)有67 對(duì)引物顯示多態(tài)性,反映了這2 個(gè)自交系在遺傳物質(zhì)上的差異。楊官品等用一個(gè)多拷貝微衛(wèi)星DNA 標(biāo)記分析了238 份栽培水稻的遺傳多樣性及遺傳多樣性從農(nóng)家品種到現(xiàn)栽培品種的動(dòng)態(tài)變化,共檢測(cè)出16 種長(zhǎng)度變異類(lèi)型和32種表現(xiàn)型,表現(xiàn)了較高的多態(tài)性。Turuspekov Y等用微衛(wèi)星引物分析了代表日本主要栽培地區(qū)的18 種大麥品種的遺傳多樣性,Shannon信息含量最高的是Kanto 地區(qū),為0.524；而含量最低的是Tohoku 地區(qū),為0.264。遺傳距離從Tohoku 和Tozan 地區(qū)的0.105 到Shikoku 和Kyushu 地區(qū)的0.88 。通過(guò)聚類(lèi)分析表明,同一地區(qū)栽培的品種大都?xì)w為一類(lèi),這反應(yīng)了大麥在日本在栽培不但受歷史親緣關(guān)系的影響,同時(shí)也有地理和環(huán)境因素的影響。Tanya P 等用SSR 對(duì)5 個(gè)韓國(guó)大豆品種、8 個(gè)泰國(guó)大豆品種和3 個(gè)野生大豆進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

由于微衛(wèi)星重復(fù)單位數(shù)量多，重復(fù)單位片段短，且重復(fù)程度不一樣，同一類(lèi)微衛(wèi)星可分布在整個(gè)基因組的不同位置上，可將隨機(jī)PCR標(biāo)記沿著染色體錨定在已知位置，因而可以用作功能基因定位。由于微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)源于基因本身的序列，因而通過(guò)對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記的定位，也就相應(yīng)地定位了其來(lái)源基因。Beckmman和Soller 認(rèn)為, 多態(tài)的簽條微衛(wèi)星( Sequence - tagged Microsatellite site ,STMS) 對(duì)基因定位提供了有效的標(biāo)記。

遺傳連鎖圖譜是利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析來(lái)反應(yīng)遺傳標(biāo)記之間的相對(duì)關(guān)系。現(xiàn)在使用最廣泛的是微衛(wèi)星標(biāo)記。其基本原理是：以微衛(wèi)星位點(diǎn)為基礎(chǔ)，在基因組中每隔一定距離找一個(gè)多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，當(dāng)這些標(biāo)記達(dá)到足夠的飽和度（約每隔10-20cm一個(gè)，并覆蓋90%的基因組）后，則可借助微衛(wèi)星標(biāo)記找到基因組中的任何功能基因和QTL，并進(jìn)行連鎖分析，從而確定QTL在圖譜的位置、與標(biāo)記之間的遺傳距離和QTL的表型效應(yīng)。Akkaga等將121個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記整合到水稻四個(gè)群體的RFLP框架圖上，平均每16-20cm就有一個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。擬南芥、水稻、番茄、土豆和玉米在遺傳圖譜上1cm分別相當(dāng)于物理距離的150kb、300kb、500kb、1000kb和1500kb。相信隨著分子遺傳標(biāo)記技術(shù)尤其是微衛(wèi)星技術(shù)的進(jìn)一步完善,對(duì)于構(gòu)建基因文庫(kù)將會(huì)起到進(jìn)一步的推動(dòng)作用。

基因組中各微衛(wèi)星位點(diǎn)除重復(fù)數(shù)不同外，其堿基組成和結(jié)構(gòu)是相似的，因此可以以微衛(wèi)星的核心序列如（AC）n、（TG）n等作為多位點(diǎn)探針，在基因組中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)。由于不同個(gè)體、品種（系）或群體在被檢測(cè)位點(diǎn)上存在一定的差異，通過(guò)電泳及雜交，這些差異將表現(xiàn)為雜交帶的有無(wú)，即產(chǎn)生微衛(wèi)星DNA指紋圖。B.Beyerman等通過(guò)DNA指紋印跡技術(shù)，利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列（GATA）₁和（GTG）₅作探針，證實(shí)了大麥和甜菜DNA指紋印跡區(qū)帶的顯著差異。

3.5 用于種質(zhì)鑒定和品種分類(lèi)

由于微衛(wèi)星座位的復(fù)等位性，使它易于鑒別同一物種的不同基因型。Guilford等利用（GA）₁₅（GT）₁₅作為探針篩選蘋(píng)果基因組文庫(kù)，證明了這些重復(fù)序列的多態(tài)性，并且利用3個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記就能足以區(qū)分21個(gè)蘋(píng)果品種。Akagi等利用高度多變的含（AT）n的17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，成功地區(qū)分了59個(gè)親緣關(guān)系極近的粳稻品種。Aranzana MJ用SSR對(duì)100個(gè)桃品種進(jìn)行分析，用7個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)得到32個(gè)等位基因，可區(qū)分78個(gè)不同的基因型。

微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇具有很大的潛力，它改變了從表型值推斷基因型值的選擇過(guò)程。分子標(biāo)記輔助選擇相對(duì)于傳統(tǒng)的表型選擇來(lái)說(shuō)，可以獲得更大的遺傳進(jìn)展，尤其對(duì)于低遺傳力性狀、限制性狀和后期表達(dá)的性狀，能增大選擇強(qiáng)度，縮短世代間隔，提高選擇的準(zhǔn)確性。Zhang等利用微衛(wèi)星標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)產(chǎn)量和估計(jì)雜種優(yōu)勢(shì)。