RNAi的機理與應用
RNAi 技術(shù)的機理與應用
關(guān)于 RNAi 技術(shù)
RNA 干擾（RNA interference,RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA( double-stranded RNA，dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。
RNAi 受到追捧的原因主要有兩個方面，一方面， RNAi 可以說是基因功能檢驗的試金石，利用 RNAi 技術(shù)可以縮短人類對人類基因功能的了解和認識的時間，在不久的將來有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚；另一方面，科研人員有望利用這種技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是生物技術(shù)界追捧的對象。
2002年，《自然》及《科學》兩本重量級學術(shù)期刊把 RNA干擾技術(shù)視為生命科學領(lǐng)域重大突破，認為足以比肩 20 世紀早期發(fā)現(xiàn)抗生素，開啟了基因治療的另一個方向。
2006年10月，2006年度諾貝爾醫(yī)學獎被授予美國斯坦福醫(yī)學院病理學和遺傳學教授安德魯·菲爾和馬薩諸塞州醫(yī)學院分子醫(yī)學教授克雷格·梅洛，表彰他們發(fā)現(xiàn) RNAi機理。
RNAi迄今已對制藥業(yè)和生物技術(shù)工業(yè)產(chǎn)生巨大影響。這也是諾貝爾獎評審委員會為什么不堅持研究成果要經(jīng)過數(shù)十年實踐驗證的“慣例”，破格為菲爾和梅洛頒獎的原因之一。
目前，RNA干擾治療技術(shù)正在快速進入人體試驗階段，已有多個 siRNA 藥物進入臨床試驗，其中第一個RNAi藥物 Bevasiranib（美國 Acuity Pharmaceuticals 公司）已處于Ⅲ期臨床試驗階段，有望于 2009 年獲準上市。
RNAi 機理
遺傳物質(zhì) ，化學名稱是“脫氧核糖核酸”，簡稱 DNA 。 DNA 包含約二萬多個蛋白質(zhì)的密碼。當細胞決定要制造某一個蛋白質(zhì)之時，屬于該蛋白質(zhì)的 DNA 密碼便會被“影印”（專業(yè)上稱為轉(zhuǎn)錄 Transcription ），做成一份核糖核酸的“副本” RNA ，又叫 mRNA 。 mRNA 副本會去細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)“工廠”（核糖體〔 Ribosome 〕），然后，按次序?qū)⒍N胺基酸組合成一個蛋白質(zhì)�！�
一些病毒覷準上述機制，把病毒的 RNA 送入細胞，借其核糖體，生產(chǎn)自己的蛋白質(zhì)。這些以 RNA 儲存遺傳訊息的病毒，進入細胞后，會用一個自備的酶把 RNA 制造一個 DNA 的副本，以便可以銜接細胞“ DNA - mRNA - 蛋白質(zhì)”的生產(chǎn)程序。對此，細胞也有對策。方法是用一個叫 Dicer 的酶，把入侵病毒的 RNA 切成很多小段；之后，這些小段 RNA 會很自然地、自動黏在它的 mRNA 上，干擾核糖體制造病毒的蛋白質(zhì)。這便是一個細胞保護自己的機制，稱為 RNA 干擾（ RNA Interference － RNAi ）。
RNAi 是 真核生物 中一種普遍存在且非常保守的機制 , 是一個天然的抗病毒機制。 RNAi 的作用機制可簡述為“雙鏈 RNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)的合成”，具體過程如下圖：
首先，外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的長雙鏈 RNA(long double stranded RNA, dsRNA) 首先被 Dicer 酶降解為長 21 ～ 23bp （堿基對）長度的小分子雙鏈 RNA （稱為小干擾核酸， small interfering RNA, siRNA), 這是一個依賴 ATP 的耗能過程。切割后的 siRNA 具有 3' 兩個核苷酸 TT 突出末端。
然后， siRNA 結(jié)合到核糖核酸酶復合物上形成 RNA 誘導的基因沉默復合體（ RISC ， RNA-induced silencing complex ）。該復合體依賴 ATP 釋能而解聚 siRNA 雙鏈成單鏈以激活 RISC �；罨� RISC 通過由 siRNA 決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導致基因沉默效應。
然后， siRNA 結(jié)合到核糖核酸酶復合物上形成 RNA 誘導的基因沉默復合體（ RISC ， RNA-induced silencing complex ）。該復合體依賴 ATP 釋能而解聚 siRNA 雙鏈成單鏈以激活 RISC �；罨� RISC 通過由 siRNA 決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉(zhuǎn)錄體，最終導致基因沉默效應。
同時， RNAi 過程中又有新的 dsRNA 分子合成 , 當 siRNA 反義鏈識別并結(jié)合靶 mRNA 后 , siRNA 反義鏈可作為引物 , 以靶 mRNA 為模板，在依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶 (RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的 dsRNA , 然后由 Dicer 切割產(chǎn)生新的 siRNA , 新 siRNA 再去識別新一組 mRNA, 又產(chǎn)生新的 siRNA, 經(jīng)過若干次合成切割循環(huán) , 沉默信號就會不斷放大。正是這種稱為靶序列指導的擴增 (target2directed amplification) 機制賦予了 RNAi 的高效性和持久性。
siRNA 作為 RNAi 的中介分子，是一種具有 3' 兩個核苷酸 TT 突出末端的 21 ～ 23bp 大小的雙鏈核糖核酸，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。
RNAi 應用
RNAi 作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具， RNAi 的應用主要集中在兩個方面：基因功能的研究、核酸干擾（RNAi）治療。
• 基因功能研究
二十世紀最偉大的生物工程 --- 人體基因組工程，在美國主導和全球共同合作下，歷經(jīng) 15 年，耗資 300 億美元，于 2000 年成功地將人體基因組的 30 億個基因密碼解析出來。雖然對總數(shù)約 3 萬的人體基因的結(jié)構(gòu)己清楚，但對于各種基因產(chǎn)物的功能如何？怎么在人體中發(fā)揮作用？哪些和疾病關(guān)聯(lián)以及如何用于治療疾病等諸如此類的問題還是束手無策。
與此同時，用基因工程學的方法修正或替換缺陷基因的基因療法已成為基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學研究的熱門課題。而實施基因療法的前提是了解疾病相關(guān)基因 , 并用特定技術(shù)，如基因敲除 (gene knock-out) 驗證其功能。
借助 RNAi 技術(shù)，研究者們可對目標基因進行特異性地表達沉默，通過觀察其表達被抑制后細胞以至生物體從形態(tài)到各項生理生化的變化，對該基因的功能及參與的信號網(wǎng)絡進行研究。與其他方法相比， RNAi 技術(shù)在基因功能研究上有其獨特的優(yōu)點 : ①簡單易行 , 容易開展； ②與基因敲除相比，實驗周期短、成本低；③與反義技術(shù)相比，具有高度特異性和高效性； ④可進行高通量 (high throughout) 基因功能分析。
• RNAi治療
由于 RNAi 是針對轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對于傳統(tǒng)基因治療對基因水平上的敲除，整個流程設計更簡便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開辟了新的途徑。其總體思路是通過加強關(guān)鍵基因的 RNAi 機制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進程或外源致病核酸的復制及表達。
因此，尋找能導致特定基因沉默的 siRNA ，即可以此開發(fā)出特異性的高效 siRNA 藥物。目前，多數(shù)藥物的作用靶點為蛋白質(zhì) , 要研制這類藥物必須對蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)有深入了解 , 而研制以 mRNA 為靶點的 RNAi 療法則不會受制于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的進展。
RNAi 專業(yè)術(shù)語
核酸干擾 （RNA interference, RNAi）
核酸干擾是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈 RNA ( double-stranded RNA ， dsRNA) 誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。 RNAi 一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，迅速成為生物學研究領(lǐng)域最為活躍的熱點之一，《 Science 》在 2001 年將其列為十大科學成就之一， 2002 年又將其列為十大科技之首； 《 Nature 》也將 siRNA 評為 2002 年度最重要的科技發(fā)現(xiàn)之一； 2006 年發(fā)現(xiàn) RNAi 機理的兩位美國科學家法爾和梅洛獲得諾貝爾醫(yī)學獎。
RNAi 技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，是一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具，已被廣泛 用于探索基因功能、病毒性疾�。ㄖ饕前滩『透窝祝┘皭盒阅[瘤的基因治療領(lǐng)域。一方面， RNAi 是基因功能檢驗的試金石，利用 RNAi 技術(shù)可以大幅度縮短人類對人類基因功能與作用的了解和認識的時間；另一方面，可以利用 RNAi 技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，即 siRNA 藥物。
小干擾核酸（siRNA）
小干擾核酸（英文縮寫：siRNA ；中文簡稱：小核酸）是帶有特定基因密碼的雙鏈短小核酸，一般長度為 21-23bp （堿基對）。 通俗地講，一個基因通常含有有數(shù)千個 bp ， siRNA 是其中長度為 21 ～ 23bp 的某一段特異序列。
siRNA 可以克隆到 siRNA 表達載體，其功能是在哺乳動物細胞內(nèi)和特定靶基因的信使核糖核酸（ mRNA ）結(jié)合，使之降解，失去靶基因表達而“沉默”下來，即“關(guān)閉”該基因的功能。這種 siRNA 降解 mRNA 從而阻斷特定蛋白質(zhì)合成的機制即為核酸干擾（ RNAi ）。
標簽：
RNAi siRNA 核酸干擾
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