多功能酶標(biāo)儀中熒光檢測技術(shù)介紹

熒光分析技術(shù)是一種強(qiáng)大的分析手段，廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)中，是多功能酶標(biāo)儀的重要應(yīng)用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以應(yīng)用于熒光檢測。

室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時發(fā)光，光照切斷時發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時，發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪�失的叫磷光，吸收化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光，由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。

由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說的熒光為分子熒光。通過測定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度，可以對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。

熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛，可以進(jìn)行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細(xì)胞學(xué)分析（細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒理，細(xì)胞吸附等）和分子間相互作用。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小 亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

體外細(xì)胞毒性研究對于檢測新的生物來源或人工合成的細(xì)胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測都有著重要的意義。細(xì)胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細(xì)胞膜，熒光密度越高反映出其受損細(xì)胞越多。

Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca²⁺熒光指示劑，可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)結(jié)合鈣離子時，最大激發(fā)波長會發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca²⁺濃度有著定量的關(guān)系。

1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時，可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光，如果在激發(fā)時熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運(yùn)動狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對這個熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，如受體配體結(jié)合分析，DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合分析，SNP分析，酶活性分析。

熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達(dá)亞納摩爾級范圍，重復(fù)性好，操作簡便，也更為安全可靠，不會在實(shí)驗(yàn)過程中生成有害的放射性廢物，此外熒光偏振是真正均相的，允許實(shí)時檢測（動力學(xué)檢測），對于濃度變化不敏感，是均相檢測形式（中間不含洗滌步驟）的最佳解決方案。

目前市場上多款酶標(biāo)儀都可以用來做熒光偏振檢測，Invitrogene公司專門利用Predictor™ hERG對多款酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光偏振測試分析（表1）。

在做熒光測定的時候，由于背景熒光信號干擾，使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測的靈敏度就會嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此使用長衰減壽命的標(biāo)記物就可以使瞬時熒光干擾減到最小化。

時間分辨熒光是用稀土元素作為標(biāo)記物，稀土三價離子的電子云的結(jié)構(gòu)會一定程度上限制了電子的遷移，導(dǎo)致這類元素發(fā)生的熒光的衰減周期通常是很長的，從而消除背景熒光的干擾 大大提高檢測的靈敏度（表2）。應(yīng)用稀土元素作標(biāo)記物的另一個好處是激發(fā)光與發(fā)射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發(fā)光和散射光的干擾，同時, 被激發(fā)的熒光光帶極窄, 熒光的發(fā)射峰非常尖銳, 可使儀器調(diào)整在極窄的波長范圍內(nèi)測定, 極大地降低了來自背景的各種干擾。

熒光團(tuán)	熒光壽命（ns）
非特異熒光背景	1～10
人血清白蛋白	4.1
球蛋白	3.0
細(xì)胞色素C	3.5
異硫氰酸熒光素(FITC)	4.5
丹磺酰氯	14
稀土螯合物	103～106

表2.常見熒光團(tuán)隊(duì)熒光壽命

時間分辨熒光靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、標(biāo)記物制備簡便、檢測重復(fù)性好、操作流程短，適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)上的超微量分析，像激素檢測，病毒性肝炎標(biāo)志物檢測，靶向細(xì)胞的標(biāo)記檢測以及藥物篩選等方面。

熒光共振能量傳遞現(xiàn)象是Perrin在20世紀(jì)初首先發(fā)現(xiàn)的，1948年，F(xiàn)oster創(chuàng)立了理論原理，指熒光能量供體與受體間通過偶極－偶極耦合作用轉(zhuǎn)移能量的過程，這種能量的轉(zhuǎn)移是非放射性的，產(chǎn)生FRET的條件主要有三個：（1）供體與受體間足夠靠近（1～10 nm）；（2）供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定的重疊；（3）給體與受體的偶極具一定的空間取向，這是偶極－偶極耦合作用的條件。

熒光共振能量傳遞因?yàn)橐�考慮到供體和受體之間的距離，所以經(jīng)常用來研究分子間的相互作用，像蛋白質(zhì)的相互作用，抗原抗體結(jié)合，受體與配體的結(jié)合，另外在膜反應(yīng)、離子通道等方面的研究也有相應(yīng)應(yīng)用。將FRET熒光探針標(biāo)記的肽鏈，加入到固體表面的雙層膜中，通過熒光漂白恢復(fù)（FRAP）成像技術(shù)檢測，為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個新的方法。用FRET標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，應(yīng)用時間分辨技術(shù)，檢測其對P2X離子通道的門控作用。

利用Eu等長效熒光物質(zhì)作為供體，來進(jìn)行熒光共振能量傳遞，在激發(fā)光熄滅后受體仍能較長的能量衰減時間，能量傳遞效率更高，可檢測的相互作用距離更長，可達(dá)到100-200nm，時間延遲檢測，降低了背景噪音，提高了靈敏度

熒光法靈敏、準(zhǔn)確、兼容性強(qiáng)、可以利用熒光分子對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性標(biāo)記大大減少雜質(zhì)的信號干擾，熒光特性參數(shù)多，動態(tài)線性范圍寬、可以活細(xì)胞活活體檢測，靈敏度比分光光度法高2～4個數(shù)量級，對微量和痕量藥物進(jìn)行靈敏準(zhǔn)確的檢測具有較大的優(yōu)越性�？傊疅晒夥ㄗ鳛橐环N高靈敏的分析手段，與其它技術(shù)相結(jié)合，有著更廣闊的發(fā)展前景。