RNAi的研究進(jìn)展

 

     RNA干擾(RNA interference ,RNAi) 現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double strand RNA ,dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過程屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制( posttranscriptional gene siliencing , PTGS) 范疇。RNAi 廣泛存在于生物界,從低等原核生物,到植物,真菌,無脊椎動(dòng)物,甚至近來在哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象,只是機(jī)制也更為復(fù)雜。 

     早在1990 年進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物有關(guān)研究時(shí)偶然發(fā)現(xiàn),將全長或部分基因?qū)�入植物�?xì)胞后某些內(nèi)源性基因不能表達(dá),但這些基因的轉(zhuǎn)錄并無任何影響,并將這種現(xiàn)象稱為基因轉(zhuǎn)錄后沉默(posttranscriptional gene silencing ,PTGS) . 1996 年在脈孢菌屬(Neurospora) 中發(fā)現(xiàn)了相似現(xiàn)象,只不過將這種現(xiàn)象命名為基因表達(dá)的阻抑作用(quelling) . 首次發(fā)現(xiàn)dsRNA 能夠?qū)е禄�因沉默的線索來源于線蟲Caenorhabditis elegans 的研究。1995年康乃爾大學(xué)的研究人員Guo 和Kemphues 嘗試用反義RNA 去阻斷par－1 基因的表達(dá)以探討該基因的功能,結(jié)果反義RNA 的確能夠阻斷par21基因的表達(dá),但是奇怪的是,注入正義鏈RNA 作為對(duì)照,也同樣阻斷了基因的表達(dá)。這個(gè)奇怪的現(xiàn)象直到3年后才被解開——華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire 和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello 首次將雙鏈dsRNA ——正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。實(shí)際上每個(gè)細(xì)胞只要很少幾個(gè)分子的雙鏈RNA 已經(jīng)足夠完全阻斷同源基因的表達(dá)。后來的實(shí)驗(yàn)表明在線蟲中注入雙鏈RNA 不單可以阻斷整個(gè)線蟲的同源基因表達(dá),還會(huì)導(dǎo)致其第一代子代的同源基因沉默。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA 干擾。

     過去認(rèn)為, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在RNAi 現(xiàn)象,因?yàn)檩^長的dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能誘導(dǎo)IFN(干擾素) 生成,并激活STAT 途徑參與的PKR(dsRNA 依賴性激酶) 的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)dsRNA 本身與PKR 結(jié)合也能令其激活,繼而磷酸化翻譯起始因子eIF2a 使之失活,導(dǎo)致非特異性的蛋白質(zhì)合成障礙;另一方面,dsRNA 又能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白的2′,5′腺苷合成酶,生成   2′,5′腺苷酸,激活非特異性的RNA 酶L ,發(fā)生非特異性的RNA 降解效應(yīng)�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn), 只要dsRNA 短于30bp ,就不會(huì)促發(fā)干擾素效應(yīng),同時(shí)又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默,說明dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也能發(fā)揮一定作用,為以后的基因治療等RNAi 應(yīng)用領(lǐng)域提供了新的研究方向。 

     近年來研究發(fā)現(xiàn),干擾性小RNA( small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA) 是RNA 干擾作用(RNAi) 賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子. siRNA 是一類長約21～25 個(gè)核苷酸( nt ) 的特殊雙鏈RNA(dsRNA) 分子,具有特征性結(jié)構(gòu),即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性; siRNA 兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基. 此外,每條單鏈的3′端均有2～3 個(gè)突出的非配對(duì)的堿基RNAi 的主要過程是,dsRNA 被核酸酶切割成21～25 nt 的干擾性小RNA ( siRNA) ,由siRNA 介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA 分子. 細(xì)胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步. 細(xì)胞中dsRNA 可通過多種途徑形成,如基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;同時(shí)轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA ;病毒RNA 復(fù)制中間體;以及以細(xì)胞中單鏈RNA 為模板由細(xì)胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA等. 在線蟲( C. elegans) 可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養(yǎng)表達(dá)正義和反義RNA 的細(xì)菌獲得dsRNA。

     現(xiàn)已初步闡明RNAi 的作用機(jī)制. RNAi 的第一步是,dsRNA 在內(nèi)切核酸酶(一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶) 作用下加工裂解形成21～25 nt 的由正義和反義序列組成的干擾性小dsRNA ,即siRNA.果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為Dicer. Dicer 含有解旋酶(helicase) 活性以及dsRNA 結(jié)合域和PAZ 結(jié)構(gòu)域. 已發(fā)現(xiàn)在Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以及哺乳動(dòng)物中也存在Dicer 同類物. RNAi 的第二步是,由siRNA 中的反義鏈指導(dǎo)形成一種核蛋白體,該核蛋白體稱為RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體( RNA induced silencing complex , RISC) , 由RISC 介導(dǎo)切割靶mRNA 分子中與siRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域,從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用. RISC 由多種蛋白成分組成,包括內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA 鏈搜索活性等. 線蟲C. elegans中的MUT7(一種RNase D樣蛋白) 可能是一種3′5′外切核酸酶. 此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分,如Arabidposis 中的AGO1 ; N.Crassa 中的QDE; C. elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源。 

     最新的研究進(jìn)一步揭示,ATP 在siRNA 介導(dǎo)的RNAi 中具有重要作用. 較長dsRNA 向siRNA 的轉(zhuǎn)變要有ATP 參與. siRNA 與蛋白因子形成一個(gè)無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 復(fù)合體;隨之, siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRNA 復(fù)合體(RISC) ,此步具有ATP 依賴性. RISC 活性復(fù)合體對(duì)靶mRNA 的識(shí)別和切割作用,這一步可能不需ATP參與。

     此外,ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對(duì)siRNA 的功能具有重要作用. 上述過程中siRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變,因?yàn)閟iRNA 雙鏈體與細(xì)胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它輔助因子,含有siRNA 的活性復(fù)合體仍能識(shí)別和切割靶mRNA 分子。

     siRNA 可作為一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶(RdRp) 作用下以靶mRNA 為模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA ;新生成的siRNA又可進(jìn)入上述循環(huán). 這種過程稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈反應(yīng)(random degradative PCR) . 新生的dsRNA 反復(fù)合成和降解,不斷產(chǎn)生新的siRNA ,從而使靶mRNA 漸進(jìn)性減少,呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象. RdRp 一般只對(duì)所表達(dá)的靶mRNA 發(fā)揮作用,這種在RNAi 過程中對(duì)靶mRNA 的特異性擴(kuò)增作用有助于增強(qiáng)RNAi的特異性基因監(jiān)視功能. 每個(gè)細(xì)胞只需要少量dsRNA 即能完全關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá),可見RNAi 過程具有生物催化反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)特征。

     miRNA 與siRNA 的區(qū)別：

 

    RNAi 技術(shù)中的相關(guān)問題主要涉及以下幾點(diǎn)：

     (1) dsRNA 序列的選擇dsRNA 主要選自已知的cDNA 的開放閱讀框架(ORF) 中的基因區(qū)域。為防止mRNA 調(diào)控蛋白對(duì)RISC 與靶RNA 結(jié)合的干擾,應(yīng)避免選擇包括:1) 起始密碼子下游或終止密碼的50～100 核苷酸位置以內(nèi)的區(qū)域;2) 5′或3′端的非翻譯區(qū)域;3) 內(nèi)含子區(qū)域。此外,序列選擇時(shí)也應(yīng)避開多聚鳥苷酸序列區(qū)( ≥3 個(gè)) ,因?yàn)檫@樣容易形成四聚體結(jié)構(gòu), 抑制RNAi 作用。選擇與靶mRNA 上序列互補(bǔ)的21～23 個(gè)核苷酸長度的片段,以AA 開頭為佳,因?yàn)榇朔�能簡化dsRNA 合成過程,降低成本,而且合成的dsRNA 能更好地抵抗RNA 酶的降解。另外,盡量使dsRNA 序列中的GC含量接近50 %(45 %～55 %最佳) ,高GC 含量能明顯降低基因沉默的效應(yīng)。選擇前可以搜索BLAST數(shù)據(jù)庫,保證無其他與靶基因同源的基因存在,避免引起對(duì)其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA 均對(duì)RNAi 敏感。為確保靶基因表達(dá)的有效抑制,最好同時(shí)合成兩個(gè)或以上的針對(duì)同一基因的不同靶區(qū)域的dsRNA ;而且,標(biāo)記dsRNA 正義鏈的3′端對(duì)RNAi 現(xiàn)象并沒有影響,現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)RNAi 有任何顯著的影響。目前,RNAi 技術(shù)主要以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為對(duì)象研究其基因的功能。但> 30bp 的dsRNA 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中會(huì)引起干擾素樣效應(yīng),導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。因而直接選用其下游的產(chǎn)物分子siRNA 來代替,達(dá)到基因研究的目的。

     (2) dsRNA 的導(dǎo)入方法不同的生物體可以選擇不同的方法。簡單生物,如單細(xì)胞生物等,可選用電穿孔的方法; 較復(fù)雜生物可選用dsRNA 微注射入生殖細(xì)胞或早期胚胎,線蟲也能采用腸道或假體腔注射的方法,與微注射相比,RNAi 效率上并無顯著差別。還有浸泡法、工程菌喂養(yǎng)法、磷酸鈣共沉淀法等。若使用的是化學(xué)法人工合成的siRNA(正義鏈和反義鏈) ,還要經(jīng)過退火過程,以雙鏈的形式導(dǎo)入靶細(xì)胞。有人提出了以質(zhì)�；虿《緸檩d體,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染途徑,在細(xì)胞內(nèi)以DNA 為模板,利用RNA 聚合酶Ⅲ,轉(zhuǎn)錄為siRNA(直接形成雙鏈或通過回文序列折疊后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)) ,也能產(chǎn)生較明顯的RNAi 效應(yīng)。最近,又有一種新的導(dǎo)入方法,就是借助高壓水槍的外力將構(gòu)建的質(zhì)粒直接自小鼠的尾靜脈注入體內(nèi),觀察RNAi 在活體生物模型而不是培養(yǎng)細(xì)胞上的基因沉默效應(yīng) ,但觀察到的siRNA 的半衰期較短,而且由于使用了高壓的外力,過程較復(fù)雜,限制了其在人類疾病治療方面的應(yīng)用。而Pachuk 等則提出了肌注的方法,將針對(duì)IL－12 的siRNA 的質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入小鼠體內(nèi),得到的RNAi 效應(yīng)更持久。

     (3) 發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的siRNA實(shí)驗(yàn)證明,發(fā)夾樣siRNA 能延長在細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。此類結(jié)構(gòu)可由具有回文序列的核苷酸鏈形成。但通�；匚慕Y(jié)構(gòu)不易獲得,也可用頭碰頭的對(duì)稱序列來代替。轉(zhuǎn)錄發(fā)夾樣siRNA 的模板必須與載體轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子緊密相連,而且盡可能有最短的多聚腺苷酸尾巴,這樣才能誘導(dǎo)高效的RNAi 效應(yīng)。Paddison 等提出類似的結(jié)構(gòu)也可應(yīng)用于長片段dsRNA (500bp 左右) ,而不會(huì)引起RNA 非特異性的降解。這為檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞中經(jīng)過長期發(fā)育后的基因功能提供了新的途徑。

    RNAi 的應(yīng)用領(lǐng)域及前景：RNAi 是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù),近年來發(fā)展迅速,很快就成為功能基因組研究的有力工具。通過實(shí)驗(yàn)手段將dsRNA 分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), 特異性地降解細(xì)胞內(nèi)與其序列同源的mRNA ,封閉內(nèi)源性基因表達(dá),從反向遺傳的角度研究人類或其他生物基因組中未知基因的功能。早期就有人應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)分離了果蠅胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通路中的各種成分。近來也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道通過RNAi 研究細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡過程中涉及的各條途徑。在這之前,曾利用反義RNA 與靶mRNA 序列互補(bǔ)的特性來抑制其表型的發(fā)生,但由于反義RNA對(duì)內(nèi)源性表達(dá)的基因抑制作用較弱,往往會(huì)產(chǎn)生一些過渡表型,易造成對(duì)基因功能判斷錯(cuò)誤,目前已通過審批認(rèn)為臨床上具有治療作用的僅有一種藥物———Vitravene 。RNAi 技術(shù)與之相比,特異性更高,作用更迅速,副反應(yīng)小,在有效地沉默靶基因的同時(shí),對(duì)細(xì)胞本身的調(diào)控系統(tǒng)也沒有影響。最近在人類體細(xì)胞里已經(jīng)成功地對(duì)近20 種基因功能進(jìn)行了“敲除”,尤其是因此而了解了人類空泡蛋白Tsg101 對(duì)HIV 在人體內(nèi)增殖的作用,進(jìn)一步深化了對(duì)HIV 的研究。Leonid 等以脊髓灰質(zhì)炎病毒為模型,利用RNAi 來誘導(dǎo)細(xì)胞的胞內(nèi)免疫,產(chǎn)生抗病毒效應(yīng),尤其是針對(duì)RNA 病毒。對(duì)于易突變的病毒,可設(shè)計(jì)多種靶向病毒基因保守序列的dsRNA ,減少它對(duì)dsRNA 的抵抗。Maen 等也應(yīng)用RNAi 技術(shù)成功地阻斷了MCF－7 乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp21 的功能。RNAi 技術(shù)的應(yīng)用,不僅能大大推動(dòng)人類后基因組計(jì)劃(蛋白組學(xué)) 的發(fā)展,還有可能設(shè)計(jì)出RNAi 芯片,高通量地篩選藥物靶基因,逐條檢測人類基因組的表達(dá)抑制情況來明確基因的功能,并且它還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域,用RNAi 技術(shù)來抑制基因的異常表達(dá),為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟了新的途徑。