銳博生物：miRNA的特征、功能及識別方法等詳解

MicroRNAs (miRNAs)是一種大小約21—23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。據(jù)推測，這些非編碼小分子RNA（miRNAs）參與調(diào)控基因表達(dá)，但其機制區(qū)別于siRNA介導(dǎo)的mRNA降解。第一個被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs。

 

已經(jīng)被鑒定的miRNAs據(jù)推測大都是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、約70個堿基大小形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羥基，大小約21—25nt的小分子RNA片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。

 

最近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細(xì)胞中鑒定的100個新miRNAs中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區(qū)別），Lau 和Bartel 實驗室的同事更加認(rèn)為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。

 

Bantam 最早被認(rèn)為是果蠅中參與細(xì)胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉(zhuǎn)座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區(qū)域會導(dǎo)致果蠅的眼和翅重復(fù)生長，而由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導(dǎo)致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導(dǎo)入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復(fù)原來的大小。但是奇怪的是表達(dá)這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一段90bp的高度保守區(qū)，經(jīng)過RNA folding program (mfold)發(fā)現(xiàn)這個保守序列可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使得這個區(qū)段很象是一個miRNA的前體。這個結(jié)果經(jīng)過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經(jīng)過一系列的“功能缺失”—“功能恢復(fù)”實驗，證實 bantam miRNA在細(xì)胞增殖中的作用。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區(qū)找到了bantam的3個潛在的結(jié)合位點（ hid是果蠅中一個誘導(dǎo)凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉(zhuǎn)錄。

 

miRNAs的表達(dá)方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發(fā)育階段的全部細(xì)胞中都有表達(dá)，而其他的miRNA則依據(jù)某種更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奈幌嗪蜁r相的表達(dá)模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異。

 

對microRNAs (miRNAs)的研究正在不斷增加，原因是科學(xué)家開始認(rèn)識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的數(shù)百個miRNAs中的多數(shù)具有和其他參與調(diào)控基因表達(dá)的分子一樣的特征——在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達(dá)模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作為參與調(diào)控基因表達(dá)的分子，因而具有重要意義。

 

第一個被確認(rèn)的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，通過調(diào)控一組關(guān)鍵mRNAs的翻譯從而調(diào)控線蟲發(fā)育進(jìn)程(reviewed in Pasquinelli 2002)。

 

bantam miRNA是第一個被發(fā)現(xiàn)有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細(xì)胞分化和組織發(fā)育過程中起重要作用的基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如mir-14、mir-23 等。

 

在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發(fā)育過程。一是在carpel factory (car) 突變株中3個miRNAs的表達(dá)水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發(fā)育，其缺失突變株表現(xiàn)為胚胎和葉片發(fā)育的缺陷。實驗結(jié)果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數(shù)的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達(dá)也提示他們可能參與了植物組織的發(fā)育。

 

對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進(jìn)程，包括早期發(fā)育(Reinhart 2000)，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞死亡(Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003)和細(xì)胞分化(Kawasaki 2003)。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細(xì)胞白血病之間的顯著相關(guān)，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關(guān)系(Calin 2002)。

 

由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據(jù)推測miRNAs在高級真核生物體內(nèi)對基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。

 

然而，大多數(shù)miRNAs的功能仍然是個謎。

 

最早被發(fā)現(xiàn)的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認(rèn)為是通過不完全互補結(jié)合到目標(biāo)靶mRNA 3’非編碼區(qū)端，以一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)合成，阻斷mRNA的翻譯。多個果蠅miRNAs也被發(fā)現(xiàn)和他們的目標(biāo)靶mRNAs的3’非編碼區(qū)有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標(biāo)靶之間并非完全互補，這使得通過信息學(xué)的方法鑒定miRNA的目標(biāo)靶位點變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調(diào)控基因表達(dá)。miRNAs的作用目標(biāo)靶和活性機制一直是各地的研究人員的關(guān)注熱點。

 

在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標(biāo)靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉(zhuǎn)錄因子），盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標(biāo)靶，這仍是第一次發(fā)現(xiàn)miRNA 和其潛在的目標(biāo)靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

 

多個研究小組采用生物化學(xué)結(jié)合是生物信息學(xué)的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據(jù)推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉(zhuǎn)錄并通過PCR擴(kuò)增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數(shù)據(jù)庫查詢進(jìn)行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產(chǎn)物。

 

有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’  來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區(qū)域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達(dá)了。

 

盡管有數(shù)百個miRNAs通過生化或者是生物信息學(xué)的方法被鑒別出來，已經(jīng)鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經(jīng)鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設(shè)還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

 

1) miRNA的計算機RNA組學(xué)方法

 

生物信息學(xué)方法是依據(jù)在不同的物種中，其成熟的miRNA 具有較大的序列同源性以及前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)大的保守性這一特征在基因組數(shù)據(jù)庫中搜索新的miRNA 基因。該方法根據(jù)比較基因組學(xué)原理并結(jié)合生物信息軟件在已測序基因組中進(jìn)行搜索比對，根據(jù)同源性的高低再進(jìn)行RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，將符合條件的候選miRNA與已經(jīng)通過實驗鑒定的miRNA分子進(jìn)行比較分析，最終確定該物種miRNA的分布及數(shù)量。近年來隨著miRNA預(yù)測方法的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)的miRNA數(shù)量呈幾何級數(shù)增長。這些預(yù)測方法從簡單的序列比對搜索發(fā)展到現(xiàn)在的機器學(xué)習(xí)算法，程序設(shè)計越來越智能化，復(fù)雜化。

 

隨著人miRNA基因轉(zhuǎn)錄出的pri-miRNA迅速加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA，隨后被切割成miRNA：miRNA*雙體，并被選擇性地組合進(jìn)核糖核酸沉默誘導(dǎo)復(fù)合體（RISC）并進(jìn)行靶基因識別。在相似的物種中，miRNA是很保守的；但在相距較遠(yuǎn)的物種間，miRNA又有一定的分歧，尤其體現(xiàn)在pre-miRNA上。這些miRNA功能作用機制的闡明為預(yù)測軟件的研發(fā)提供了理論依據(jù)，但仍需要不斷修補和完善。近年來，幾個基于這些規(guī)則的miRNA預(yù)測程序先后被開發(fā)(表1.1)，并被廣泛使用。

 

程序名	發(fā)布于	預(yù)測目標(biāo)	適用方式	算法	輸入序列格式	適用長度	涉及的程序	適用于
miRscan	2003	Pre-miRNA	Web	N	兩物種比對序列	<100bp	Blast	線蟲
miRseeker	2003	Pre-miRNA	Local	N	—	—	Mfold、AVID、Blast	果蠅
ERPIN	2001	Pre-miRNA	Local/Web	—	Fasta序列、Fasta文件	—	Blast	動植物
Srnaloop	2003	Pre-miRNA	Local	N	Fasta序列	—	RepeatMasker、Blast、RNAfold	線蟲
MIRFINDER	2004	Pre-miRNA	Local	SVM	兩物種比對序列	—	RNAfold、RepeatMasker、PatScan、RNAVIZ	植物
PalGrade	2005	Pre-miRNA	Local	SVM	基因組序列	—	RNAfold	人
MiRAlign	2005	Pre-miRNA	Web	N	Fasta序列	50-300bp	RNAfold、ClustalW、RNAforester	動植物
microHARVESTER	2005	Pre-miRNA & miRNA	Web	N	pre-miRNA、miRNA	<450bp	RNAfold、Blast、T-Coffee	植物
findMiRNA	2005	Pre-miRNA & miRNA	Local	N	Fasta序列	—	RNAfold、Blast、mfold	擬南芥
miR-abela	2005	Pre-miRNA	Web	SVM	Fasta序列、Fasta文件	<1000bp	RNAfold、SVMlight	動物
BayesMiRNAfind	2006	Pre-miRNA & miRNA	Web	NBS	Fasta序列	<500Kbp	Mfold、BLAT	動物
ProMiRⅡ	2006	Pre-miRNA & miRNA	Local/Web	HMM	序列(只包含A、G和C，T或U)	70-150bp	RNAfold、Blast、pipeline vist、HMmiRNApairwise	動物
Vmir	2006	Pre-miRNA	Local	—	基因組序列	<2Mbp	RNAfold、mFold	病毒
RNAz+RNAmicro	2006	Pre-miRNA	Local	SVM	多物種比對序列	<400bp	RNAz、libSVM	動物
Microprocessor SVM	2006	Drosha剪切位點	Local/Web	SVM	Fasta序列	<180bp	RNAfold、ScorePin、 Gist SVM	動物

 

2) miRNA的靶基因預(yù)測方法

 

miRNA的研究意義之重大是毋庸置疑的。然而，與新的miRNA的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對緩慢。到目前為止，在發(fā)現(xiàn)的4449多個miRNA中，確定功能的miRNA僅有幾十個。導(dǎo)致miRNA功能研究進(jìn)展緩慢的非常重要的原因是miRNA的作用靶標(biāo)難以確定。事實上，通過實驗方法確定miRNA的作用靶標(biāo)非常耗時，目前尚無高通量的靶標(biāo)鑒定方法。因此，通過理論方法預(yù)測miRNA的作用靶標(biāo)成為當(dāng)前識別miRNA作用靶標(biāo)的較為理想的途徑。以下重點介紹幾種經(jīng)典預(yù)測軟件的算法分析，其他軟件（表1.2）請查看相應(yīng)網(wǎng)站

 

表1.2  miRNA靶序列預(yù)測程序及查詢數(shù)據(jù)庫 Table1.2 miRNA target prediction programs and related databases
靶序列預(yù)測程序	適用物種	相關(guān)網(wǎng)站
EMBL miRtarget prediction	果蠅	http://www.russell.embl-heidelberg.de/miRNAs
miRanda	果蠅，脊椎動物	http://microrna.org/miranda.html
PicTar	脊椎動物，果蠅	http://pictar.bio.nyu.edu
TargetScan,TargetScanS	脊椎動物	http://genes.mit.edu/targetscan
RNA hybrid	果蠅	http://www.techfak.uni-bielefeld.de/persons/marc/mirna/targets
ViTa	病毒	http://vita.mbc.nctu.edu.tv
miTargert	動物	http://cbit.snu.ac.kr/~miTarget
MovingTarget	果蠅	——
MiRTif	動物	http://mirtif.bii.a-star.edu.sg
miRacle	動物	http://miracle.igib.res.in/miracle
PatScan	植物	Rhoades et al. (2002)
microTar	動物	http://tiger.dbs.nus.edu.sg/microTar
EIMMo	人，果蠅，線蟲，斑馬魚	http://www.mirz.unibas.ch/ElMMo
miRU	植物	http://bioinfo3.noble.org/miRNA/miRU.html
DIANA-MicroT	人，鼠	http://diana.pcbi.upenn.edu/DIANA-microT
RNA22	動物	http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html
MicroInspector	動植物、病毒	http://mirna.imbb.forth.gr/microinspector
試驗驗證靶序列數(shù)據(jù)庫
mirBase		http://www.microrna.sanger.ac.uk/targets/v2
TarBase		http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase.html
Argonaute		http://www.rna.uni-heidelberg.de/apps/zmf/argonaute/interface
miRNAMAP		http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw
miRGen		http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi

　

 

 

miRNA和siRNA之間的關(guān)系令人迷惑。從表面上說，一個是非編碼的單鏈小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性；另一個是針對編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標(biāo)靶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。由于每個mRNA模版可能產(chǎn)生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進(jìn)化進(jìn)程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關(guān)的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。

 

然而，據(jù)推測miRNAs通常是由較大的（70­90 nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）前體經(jīng)Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負(fù)責(zé)將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調(diào)控基因表達(dá)功能。因而這兩類小分子RNA之間的關(guān)系格外令人關(guān)注。

 

兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結(jié)合到目的mRNA靶的3’非編碼區(qū)(3’UTRs)，通過一種未知方式誘發(fā)蛋白質(zhì)翻譯抑制從而抑制蛋白質(zhì)合成。這種結(jié)合并不誘導(dǎo)mRNA靶的降解，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應(yīng)mRNA的豐度，其原因據(jù)推測是由于miRNA和結(jié)合位點之間不完全互補。這就區(qū)別于siRNA的介導(dǎo)的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導(dǎo)目的RNA的降解。實驗表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補的miRNA會誘導(dǎo)mRNA靶的降解。還有實驗結(jié)果表明一些miRNA，包括在植物中發(fā)現(xiàn)的Scarecrow miRNA，能結(jié)合完全互補的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種小分子RNA作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。

 

一個很有趣的實驗證實這個觀點：Doench和同事挑選一個已知在體內(nèi)可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應(yīng)的CXCR4結(jié)合位點——其中一個拷貝是插入一個完全匹配的CXCR4結(jié)合位點，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結(jié)合位點，這樣選定的siRNA就不能完全結(jié)合到這個結(jié)合位點——中間形成一個突起的不匹配的環(huán)。將這兩個拷貝轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞并用siRNA誘導(dǎo)基因沉默。結(jié)果很有趣——兩個實驗都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍，RT-PCR和Northern分析證實，第一個實驗的熒光素酶轉(zhuǎn)錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導(dǎo)的RNAi反應(yīng)，目標(biāo)靶mRNA降解導(dǎo)致表達(dá)水平的下降，而第二個實驗中熒光素酶轉(zhuǎn)錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達(dá)水平下看起來象源于miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制降，而不是siRNA介導(dǎo)的影響mRNA的穩(wěn)定性導(dǎo)致。實驗表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于mRNA。實驗人員還進(jìn)行了另一個實驗：改變第二個實驗中的不匹配環(huán)的堿基序列看起來不影響抑制效果，但是siRNA和報告基因上的結(jié)合位點的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點和siRNA抑制的情況一樣——唯一不同的是：完全匹配的結(jié)合位點（siRNA作用方式）可以單獨起作用而相互不影響，而增加不完全配對的結(jié)合位點（注意在第二個實驗中用了4個CXCR4結(jié)合位點）的個數(shù)對翻譯抑制有顯著的加乘作用。

 

在哺乳動物細(xì)胞中還沒有找到內(nèi)源的siRNA，外源的siRNA介導(dǎo)的RNAi作用正是一種抵御機制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中，從理論上推測可能參與多種調(diào)控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關(guān)系的本質(zhì)就顯得更加撲朔迷離。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的小分子RNA都成為一個值得關(guān)注的問題。

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