高靈敏度化學(xué)發(fā)光技術(shù)應(yīng)用心得

在轉(zhuǎn)印過(guò)程中將產(chǎn)生大量熱量，因此對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度要有一定的限制。轉(zhuǎn)印中產(chǎn)生的焦耳熱（Joule）與電源參數(shù)P成正比，P=I*V=I²R。電泳轉(zhuǎn)印緩沖液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高，此時(shí)其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會(huì)使轉(zhuǎn)印過(guò)程和電場(chǎng)強(qiáng)度發(fā)生變化，從而影響電轉(zhuǎn)印緩沖液的緩沖能力。同時(shí)，系統(tǒng)過(guò)熱還會(huì)引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉(zhuǎn)印效率。


本室主要以濕轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)印，因此本文就濕轉(zhuǎn)為例，對(duì)化學(xué)發(fā)光和ChemiDoc XRS的應(yīng)用進(jìn)行敘述。
一、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）：
（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。
（2）在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過(guò)的PVDF膜。
（3）打開(kāi)夾子將黑的一面放入轉(zhuǎn)膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。
     注意:1整個(gè)過(guò)程在轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行在鋪每一層時(shí)要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。
          2撬玻璃板剝膠時(shí)動(dòng)作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對(duì)齊
（4）將夾子合好，放到轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面對(duì)槽的紅面。接通電電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準(zhǔn)備好的冰盒來(lái)降溫。將整個(gè)電泳槽放入一個(gè)大的容器中（大的塑料泡沫盒子最好），在這個(gè)容器中盛滿冰。
（5） 250毫安恒流轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。
（6）2小時(shí)后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。
（7）用5%脫脂奶粉室溫封閉。
封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。
脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進(jìn)行封閉，且足以覆蓋住膜。
二、孵育一抗
     一抗用BSA溶解，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)上的要求稀釋抗體（大部分稀釋度為1：1000），4℃過(guò)夜。  也可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短時(shí)間。
（有些一抗室溫孵育一小時(shí)也可得到滿意的結(jié)果）
三、孵育二抗
室溫孵育1小時(shí)。 一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:2000。
二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。
注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時(shí)間一定要夠。
洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。
四、曝光
      本實(shí)驗(yàn)室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測(cè)試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒（已針對(duì)CCD成像做了優(yōu)化），可獲得更好的效果。
（1）洗膜，2至3次，每次5分鐘
（2）在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。
作用：a 保證PVDF膜能在一個(gè)相對(duì)干凈的平臺(tái)上曝光，避免污染。
        b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當(dāng)半透明的PVDF膜在白測(cè)光下照Marker時(shí)，會(huì)更清晰、明顯。
（3）將膜放入照膠儀，調(diào)整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標(biāo)一個(gè)印記。
（4）選擇EPI WHITE 光，點(diǎn)擊“White Epi IIIumination”點(diǎn)擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調(diào)至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉(zhuǎn)至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。
（5）將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關(guān)閉WHITE EPI光（注意膜的位置從照Marker開(kāi)始，不要改變）點(diǎn)擊“Chem Hi Sensitivity”，點(diǎn)擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時(shí)間，張數(shù)，選擇指定文件夾，保存。
選擇比較滿意的圖片，按如上所說(shuō)轉(zhuǎn)換至jpeg格式。
例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調(diào)至10s一張，一般10張之內(nèi)就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。
        對(duì)于內(nèi)參來(lái)說(shuō)，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時(shí)會(huì)得到理想的效果。
（6）marker與目的條帶的比對(duì)：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開(kāi)jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點(diǎn)住剛剛用圓珠筆畫(huà)的印記，手不要松開(kāi)，此時(shí)還用“圖片和傳真查看器”打開(kāi)jpeg格式的目的條帶的圖片，手點(diǎn)的地方就是剛才marker的位置。

白測(cè)光下獲取的marker圖像



化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶    蛋白上樣量：120μg  分離膠濃度：12%

化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶  蛋白上樣量：80μg  分離膠濃度：12%


白測(cè)光下獲取的marker圖像


化學(xué)發(fā)光下目的蛋白條帶  蛋白上樣量：50μg  分離膠濃度：15%


結(jié)論：采用Bio-Rad的冷CCD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)，比傳統(tǒng)的暗室曝光方法更為簡(jiǎn)便，也大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。但在成像時(shí)需要注意選擇合適的化學(xué)發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測(cè)。且大部分的化學(xué)發(fā)光試劑均對(duì)應(yīng)暗室曝光的方式，因此在進(jìn)行檢測(cè)需要進(jìn)行調(diào)整，如對(duì)發(fā)光液不能進(jìn)行稀釋，而必須要使用原液。同時(shí)如果條帶的表達(dá)比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長(zhǎng)的成像時(shí)間，當(dāng)然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強(qiáng)烈信號(hào)的化學(xué)發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒。

相關(guān)儀器及試劑訂貨信息
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170-8182 XciteBlue Conversion Screen and viewing goggles for SYBR Green/SYBR Safe/GFP/Flamingo Fluorescent Gel Stain

170-8184 Gel Alignment Templates

170-7950 White Light Transilluminator, universal hood

170-5070 Immun-Star WesternC Chemiluminescent Kit, includes 50 ml luminol/enhancer, 50 ml peroxide solution

161-0376 Precision Plus Protein WesternC Standards, 250 ul, 50 applications

ChemiDoc XRS system



 

WesternC 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品效果圖及化學(xué)發(fā)光后成像效果圖

Bio-Rad Western blotting解決方案