多肽物質(zhì)分離與分析方法研究進(jìn)展

　　摘　要　綜述了近幾年來多肽類物質(zhì)的提取分離與分析方法，主要包括高效液相色譜法、電泳、質(zhì)譜及核磁共振等方法在肽類物質(zhì)研究中的最新應(yīng)用進(jìn)展。
　

　　多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對具有一定生物學(xué)活性的多肽的研究，一直是藥物開發(fā)的一個(gè)主要方向。生物體內(nèi)已知的活性多肽主要是從內(nèi)分泌腺組織器官、分泌細(xì)胞和體液中產(chǎn)生或獲得的，生命活動(dòng)中的細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變、免疫調(diào)節(jié)等均與活性多肽密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，從天然產(chǎn)物中獲得肽類物質(zhì)的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應(yīng)用，不斷有新的肽類物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質(zhì)分離、分析的主要方法研究進(jìn)展。 1　分離方法
　　采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質(zhì)的性質(zhì)決定。對蛋白質(zhì)、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等［1］。這些方法常常組合到一起對特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化，同時(shí)上述這些方法也是蛋白、多肽類物質(zhì)分析中常用的手段，如層析、電泳等。

1.1　高效液相色譜（HPLC）
　　HPLC的出現(xiàn)為肽類物質(zhì)的分離提供了有利的方法手段，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、多肽的HPLC應(yīng)用與其他化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時(shí)間內(nèi)完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規(guī)模上生產(chǎn)具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質(zhì)分離制備的最佳條件上，不少學(xué)者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內(nèi)容。

1.1.1　反相高效液相色譜（RP-HPLC）
　　結(jié)果與保留值之間的關(guān)系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結(jié)構(gòu)的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數(shù)，Wilce等［2］利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質(zhì)與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數(shù)影響的關(guān)系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時(shí)間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時(shí)間。而含5～25個(gè)氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時(shí)間。同時(shí)有不少文獻(xiàn)報(bào)道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，并利用計(jì)算機(jī)處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件［3］。
　　肽圖分析(Peptide Mapping):肽圖分析是根據(jù)蛋白質(zhì)、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點(diǎn)，使用專一性較強(qiáng)的蛋白水解酶［一般為肽鏈內(nèi)切酶（endopeptidase)］作用于特殊的肽鏈位點(diǎn)將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜。肽圖分析對多肽結(jié)構(gòu)研究和特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質(zhì)，通過RP-HPLC法采用C18柱檢測了重組人生長激素(rhGH)的肽片斷，成功獲得了人生長激素特征性胰肽圖譜［4］。同時(shí)胰島素的肽圖經(jīng)V8酶專一裂解也制得，并可鑒別僅相差一個(gè)氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素［5］。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結(jié)構(gòu)也應(yīng)用酶解法及在線分析技術(shù)確定了肽圖，便于鑒定分析。此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在新藥開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。

1.1.2　疏水作用色譜(Hydrophobic interaction chromatography,HIC)
　　HIC是利用多肽中含有疏水基團(tuán)，可與固定相之間產(chǎn)生疏水作用而達(dá)到分離分析的目的，其比RP-HPLC具有較少使多肽變性的特點(diǎn)。利用HIC分離生產(chǎn)激素（GH）產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)與活性比RP-HPLC分離的要穩(wěn)定，活性較穩(wěn)定。Geng等［6］利用HIC柱的低變性特點(diǎn)，將大腸桿菌表達(dá)出的經(jīng)鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ，通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產(chǎn)品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經(jīng)離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達(dá)到這一要求。

1.1.3　分子排阻色譜(Size-Exclusion chromatography,SEC)
　　SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質(zhì)，特別對一些較大的聚集態(tài)的分子更為方便。如人重組生長激素（hGH)的分離，不同結(jié)構(gòu)、構(gòu)型的GH在SEC柱上的分離行為完全不同，從而可分離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEG具有半衰期長、作用強(qiáng)的特點(diǎn)［7］。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。

1.1.4　離子交換色譜(Iron-Exchange chromatography,IEXC)
　　IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質(zhì)的分離分析研究中，對多肽的性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強(qiáng)度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等［8］報(bào)道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐酶異構(gòu)體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價(jià)值的數(shù)據(jù)供今后此類物質(zhì)分離研究。

1.1.5　膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)
　　CMP+分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級分離的目的［9］。

1.1.6　高效置換色譜(High-Performance Displacement Chromatography,HPDC)
　　HPDC是利用小分子的高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達(dá)到分離目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低于總量1％組分的活性人重組生長激素(rHG)［10］。在研究非毒性交換劑時(shí)Jayarama［11］發(fā)現(xiàn)硫酸化葡聚糖(Detran Sulfate,DS)是對β-乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質(zhì)量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質(zhì)量越低，越易于與固定相結(jié)合，因此在分離相對分子質(zhì)量小的多肽時(shí)，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。

1.1.7　灌注層析(Perfusion Chromatography,PC)
　　PC是一種基于分子篩原理與高速流動(dòng)的流動(dòng)相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動(dòng)相速度直接影響分離效果。試驗(yàn)證明其在生產(chǎn)、制備過程中具有低投入、高產(chǎn)出的特性［12］。目前市場上可供應(yīng)的PC固定相種類較多，適合于不同分子量的多肽分離使用。

1.2　親和層析(Affinity Chromatography,AC)
　　AC是利用連接在固定相基質(zhì)上的配基與可以和其特異性產(chǎn)生作用的配體之間的特異親合性而分離物質(zhì)的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質(zhì)上發(fā)現(xiàn)了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補(bǔ)鏈等等。對多肽類物質(zhì)分離目前主要應(yīng)用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基有天然的，也有根據(jù)其結(jié)構(gòu)人工合成的。Patel等［13］人利用一系列親合柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
　　固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)是近年來發(fā)展起來的一種親和方法。其固定相基質(zhì)上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側(cè)鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結(jié)構(gòu)最易結(jié)合到金屬離子親和柱上，純化效果較好［14］。其中胰島素樣生長因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、二氫葉酸還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產(chǎn)品。
　　Chaiken等［15］人報(bào)道了另一種親和層析方法，利用反義多肽作為配基，這種多肽是由反義DNA表達(dá)產(chǎn)生，其與正鏈DNA表達(dá)產(chǎn)生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復(fù)合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復(fù)合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結(jié)合在固定相基質(zhì)上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結(jié)合可達(dá)到分離特定結(jié)構(gòu)多肽的目的。

1.3　毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)――分離分析方法
　　CE是在傳統(tǒng)的電泳技術(shù)基礎(chǔ)上于本世紀(jì)60年代末由Hjerten發(fā)明的，其利用小的毛細(xì)管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術(shù)從80年代以來發(fā)展迅速，是生物化學(xué)分析工作者與生化學(xué)家分離、定性多肽與蛋白類物質(zhì)的有利工具。CE根據(jù)應(yīng)用原理不同可分為以下幾種；毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)、毛細(xì)管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)、毛細(xì)管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)和膠束電動(dòng)毛細(xì)管層析（Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)等。

1.3.1　毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)
　　CZE分離多肽類物質(zhì)主要是依據(jù)不同組分中的化合物所帶電荷不同，且分離效果只由帶電性決定，比傳統(tǒng)凝膠電泳更準(zhǔn)確。目前存在于CZE分離分析多肽物質(zhì)的主要問題是天然蛋白或肽易與毛吸管硅膠柱上的硅醇發(fā)生反應(yīng)，影響峰形與電泳時(shí)間，針對這些問題不少學(xué)者做了大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，如調(diào)節(jié)電泳液的pH值，使與硅醇反應(yīng)的極性基團(tuán)減少；改進(jìn)毛細(xì)管柱材料的組成，針對多肽性質(zhì)的不同采取不同的CZE柱來分離。Issaq［16］等利用CZE方法研究分離5個(gè)含9個(gè)氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低pH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2＋等，此時(shí)分離速度快而且準(zhǔn)確。

1.3.2　毛細(xì)管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)
　　由于不同的蛋白、多肽的等電點(diǎn)（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點(diǎn)pH條件下聚集沉淀下來，而與其他肽分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質(zhì)中應(yīng)用不多，主要應(yīng)用與不同來源的多肽異構(gòu)體之間的分離，如對rHG不同異構(gòu)體分離［17］。由于在CIEF柱表面覆蓋物的不穩(wěn)定性限制了此法的廣泛應(yīng)用。

1.3.3　毛細(xì)管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
　　CGE是基于分子篩原理，經(jīng)十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯(lián)、線性、疏水多聚凝膠柱被用于多肽類物質(zhì)的分離分析，此電泳法適于含疏水側(cè)鏈較多的肽分離。這種凝膠易于灌注，使用壽命長，性質(zhì)較為穩(wěn)定。

1.3.4　膠束電動(dòng)毛細(xì)管層析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)
　　MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應(yīng)用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻(xiàn)報(bào)道在電解液中加入環(huán)糊精等物質(zhì)，可使含疏水結(jié)構(gòu)組分的多肽選擇性與環(huán)糊精的環(huán)孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離［18］。

1.4　多肽及蛋白質(zhì)分離工程的系統(tǒng)應(yīng)用
　　以上提到的分離多肽的技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用過程中多相互結(jié)合，根據(jù)分離多肽性質(zhì)的不同，采用不同的分離手段。特別是在后基因組時(shí)代，對于蛋白質(zhì)組［19］深入的研究，人們對于分離多肽及蛋白質(zhì)的手段不斷改進(jìn)，綜合利用了蛋白質(zhì)和多肽的各種性質(zhì)，采用包括前面提到的常規(guī)蛋白多肽提取方法，同時(shí)利用了高效液相色譜，毛細(xì)管電泳，2-D電泳等手段分離得到細(xì)胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中系統(tǒng)應(yīng)用蛋白和多肽分離鑒定的技術(shù)是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組計(jì)劃的關(guān)鍵。其中電泳技術(shù)在此項(xiàng)研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，大大的提高了蛋白多肽類物質(zhì)的分析鑒定的效率。

2　分析方法

2.1　質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry,MS)
　　MS在蛋白、多肽分析中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，特別是在分離純化后的在線分析中，MS的高靈敏性、快速性特別適合多肽物質(zhì)分析鑒定。其中連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)和電霧離子化質(zhì)譜(Electrospray Ionization,EIS)是近幾年發(fā)展起來的新方法。

2.1.1　連續(xù)流快原子轟擊質(zhì)譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment,cf-FAB）
　　cf-FAB是一種弱離子化技術(shù)，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH＋或（M-H）形式。主要應(yīng)用于肽類的分離檢測，其具有中等分辨率，精確度大于±0.2amu，流速一般在0.5-15μl.mL-1。在測定使流動(dòng)相需加0.5％～10％基質(zhì)如甘油和高有機(jī)溶劑成分，使樣品在檢測探針處達(dá)到敏感化［20］。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結(jié)合使用達(dá)分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經(jīng)建立，并得到很好的應(yīng)用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構(gòu)相穩(wěn)定性，連接分子方面具有重要意義［21］。

2.1.2　電霧離子化質(zhì)譜(Electrospray Ionization,EIS)
　　EIS可產(chǎn)生多價(jià)離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質(zhì)量達(dá)1×105的蛋白進(jìn)行分析，分辨率在1500～2000amu,精確度在0.01％左右。EIS更適合相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)的在線分析，且需要?dú)饣�或有機(jī)溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯(lián)合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯(lián)合應(yīng)用［22］。

2.1.3　基質(zhì)輔助激光解析／離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-associated laser dissociation/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)
　　MALDI-TOF是目前蛋白質(zhì)鑒定中精確測定相對分子質(zhì)量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質(zhì)的相對分子質(zhì)量的測定，靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的必備工具。同時(shí)結(jié)合液相色譜的聯(lián)用技術(shù)可以高效率的鑒定多肽物質(zhì)。特別是當(dāng)各種原理的質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)應(yīng)用時(shí)，不但可以得到多肽的相對分子質(zhì)量信息，還可以測定它的序列結(jié)構(gòu)，此項(xiàng)技術(shù)將在未來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中起到?jīng)Q定性作用［23］。

2.2　核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)
　　NMR因圖譜信號的純數(shù)字化、過度的重疊范圍過寬（由于相對分子質(zhì)量太大）和信號弱等原因，在蛋白、多肽物質(zhì)的分析中應(yīng)用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用，分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展，使NMR逐漸成為此類物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質(zhì)有特定的形狀而便于定量與定性分析，如何減少數(shù)據(jù)處理的時(shí)間問題等［24］。這些問題多有不少學(xué)者在進(jìn)行研究。雖然在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用較少，NMR在分析分子中含少于30個(gè)氨基酸的小肽時(shí)是非常有用的，可以克服上述蛋白質(zhì)分析中的缺點(diǎn)而達(dá)到快速準(zhǔn)確分析的目的。

2.3　其他
　　除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質(zhì)譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標(biāo)記法及免疫學(xué)方法等都已應(yīng)用于多肽類物質(zhì)的結(jié)果鑒定、分析檢測之中。
　　以上簡要的介紹了近幾年多肽類物質(zhì)分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現(xiàn)，因此這一領(lǐng)域的研究具有廣闊的前景。