流式細(xì)胞術(shù)在血液學(xué)中的應(yīng)用
DNA倍體分析及細(xì)胞周期分析
在細(xì)胞周期內(nèi),DNA含量隨細(xì)胞內(nèi)時(shí)相發(fā)生周期性變化,正常情況下,大多數(shù)細(xì)胞處于休止期(Go), G1期細(xì)胞雖有DNA合成，但DNA含量仍為2N，為二倍體細(xì)胞,;處于活躍的DNA合成期(S期)的細(xì)胞DNA含量為2N-4N;正經(jīng)歷細(xì)胞分裂(G2/M期)的細(xì)胞含有最大量的DNA(4N)。細(xì)胞經(jīng)固定后用PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等熒光染料染色即可上機(jī)測定。但標(biāo)本需先經(jīng)RNA酶處理以排除RNA干擾。FCM可在測量大量細(xì)胞(數(shù)分鐘可測定105個(gè)細(xì)胞)后給出DNA分布直方圖,見圖12.10.正常人外周血DNA示意圖，圖中第一個(gè)峰(G1)是DNA含量為2N 的細(xì)胞峰, 第二個(gè)峰是DNA含量為4N 的細(xì)胞峰,兩峰之間是DNA含量為2N-4N的處于活躍的DNA合成期(S期)的細(xì)胞。用廠家提供的Multicycle軟件，計(jì)算機(jī)可自動(dòng)計(jì)算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA雙參數(shù)分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指數(shù), 如標(biāo)本中有凋亡細(xì)胞,在G1峰前會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亞G1期峰,軟件可自動(dòng)計(jì)算出凋亡細(xì)胞的%。
圖12.10.正常人外周血DNA示意圖(采自Coulter Training Guide)
DNA倍體分析的臨床有價(jià)值的指標(biāo)是DNA非整倍體和/或超二倍體%和四倍體%增高。這些改變是腫瘤細(xì)胞的特異性改變,和實(shí)體瘤相比,急性白血病非整倍體發(fā)生率較低,約30～40%。
淋巴細(xì)胞亞群測定
淋巴細(xì)胞擔(dān)負(fù)著免疫的主要功能。淋巴細(xì)胞亞群的測定有助于了解機(jī)體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測。臨床經(jīng)常測定的淋巴細(xì)胞亞群包括T淋巴細(xì)胞 (CD3+), T 輔助細(xì)胞 (CD3+CD4+), T 抑制細(xì)胞(CD3+CD8+), B 淋巴細(xì)胞（CD19+或CD20+），NK 細(xì)胞 (CD3-CD56+)等。
常用來測定淋巴細(xì)胞亞群的單克隆抗體(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗體,有直標(biāo)熒光抗體,現(xiàn)在一些國外公司有雙色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此時(shí)應(yīng)根據(jù)這些雙色或三色McAb的Ig性質(zhì)選擇相應(yīng)的陰性對照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上機(jī)測定時(shí)應(yīng)先測定陰性對照管,陰性對照的陽性細(xì)胞應(yīng)＜2.0%。
三色測定可給出更為準(zhǔn)確的各亞群的情況:如真正的T 輔助細(xì)胞應(yīng)是 CD3+CD4+CD8-, 真正的T 抑制細(xì)胞應(yīng)是 CD3+CD4-CD8+,單標(biāo)CD8+細(xì)胞中不僅有T 抑制細(xì)胞,還含有30%左右的NK細(xì)胞;而CD3+CD4-CD8-細(xì)胞群是γδT細(xì)胞,此類細(xì)胞與感染有關(guān), CD3+CD4+CD8-細(xì)胞+CD3+CD4-CD8+細(xì)胞+CD3+CD4-CD8-細(xì)胞+CD3+CD4+CD8+細(xì)胞=CD3+細(xì)胞。如單標(biāo)記CD56不能準(zhǔn)確測定NK 細(xì)胞,NK 細(xì)胞應(yīng)是 (CD3-CD56+),因?yàn)镃D56+細(xì)胞中包含著非HLA束縛細(xì)胞毒T 細(xì)胞(CD3+CD56+)。雙色組合還能測定B 淋巴細(xì)胞（CD3-CD19+或CD20+）、激活的T 細(xì)胞(CD3+CD69+或CD3+25+)等。
應(yīng)用適當(dāng)?shù)碾p色組合如CD4與CD29,CD4與CD45RA,可以測定T輔助細(xì)胞的的亞群。如CD4+2H4(CD45RA)+細(xì)胞是Ts的誘導(dǎo)細(xì)胞;CD4+4B4(CD29)+細(xì)胞Th的誘導(dǎo)細(xì)胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+S6F1可測定T抑制細(xì)胞的亞群。
T輔助細(xì)胞還可分成Th1、Th2兩個(gè)亞群，同時(shí)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4，可區(qū)分Th1細(xì)胞（CD4+/ IFN-γ+）和Th2細(xì)胞（CD4+/ IL-4+）。
利用CD25、CD69等McAb和其他淋巴細(xì)胞標(biāo)記雙色或三色標(biāo)記還可測定淋巴細(xì)胞亞群的功能狀態(tài)，如活化T8、活化B細(xì)胞等。
以下給出常用細(xì)胞亞群的正常范圍供參考,請注意同一CD中有多種克隆的McAb, 同一CD中不同McAb所測出的數(shù)值不同,每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)測定自己實(shí)驗(yàn)室的正常數(shù)值。
CD3+ 70.0±12.0% +4B4+ 23.0±7.0%
CD3+CD4+CD8- 40.0±9.0% CD4+2H4+ 19.0±6.0%
CD3+CD4-CD8+ 30.0±8.0%
CD3-CD56+(NK) 12.0±8.0%
白血病免疫分型原理
白血病免疫學(xué)分型是利用單克隆抗體(McAb)檢測白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型,以了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。對白血病細(xì)胞抗原的分析研究有助于對白血病分型,為診斷和治療提供依據(jù)。白血病免疫分型是形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國際MIC分型協(xié)作組認(rèn)為每一例急性白血病的免疫分型都是必不可少的。白血病免疫分型對鑒別急淋和急非淋有決定作用，對鑒別急非淋的某些亞型如M7、M3也有決定作用，對于一些用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞組織化學(xué)不能診斷的急性白血病，急性未分化白血病，混雜性白血病等有重要意義。自從單克隆抗體問世以來,最成功的應(yīng)用就是研究造血系統(tǒng)各類細(xì)胞表面抗原與細(xì)胞增殖、分化及惡變的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面抗原有重要功能,一些抗原分子作為細(xì)胞生長因子的受體而影響細(xì)胞的增殖分化;一些抗原分子作為細(xì)胞間相互識(shí)別的物質(zhì)基礎(chǔ)而參與細(xì)胞間相互作用;一些抗原分子則是細(xì)胞特異功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。
從多能造血干細(xì)胞(PHSC)分化成熟為功能細(xì)胞過程中, 細(xì)胞表面和細(xì)胞漿內(nèi)抗原隨著分化成熟過程不斷發(fā)生改變, 這些抗原稱為造血細(xì)胞分化抗原。造血細(xì)胞分化抗原是造血細(xì)胞分化過程中由細(xì)胞核內(nèi)染色體上的基因編碼的鑲嵌蛋白, 其出現(xiàn)、增多、減少或消失與造血細(xì)胞分化密切相而表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及分化程度相關(guān)的特異性。這些抗原可作為鑒別和分類造血細(xì)胞的標(biāo)記。如髓系細(xì)胞的MPO、CD33、CD13、CD14、CD15等抗原;巨核系的CD41、CD41、CD61抗原; T淋巴細(xì)胞的CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等抗原;B淋巴細(xì)胞的CD19、CD20、CD22等抗原。至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞特異性抗原，而白血病細(xì)胞是造血細(xì)胞在某一分化階段的大量積累,表達(dá)與之相應(yīng)的造血細(xì)胞分化抗原，因此可用造血細(xì)胞分化抗原類標(biāo)記檢測白血病細(xì)胞; 但白血病細(xì)胞畢竟不是正常造血細(xì)胞,其抗原表達(dá)與正常造血細(xì)胞并不完全相同。常有丟失某一分化發(fā)育階段正常應(yīng)有的抗原,或表達(dá)某一分化發(fā)育階段正常不應(yīng)有的抗原，或表達(dá)其他系列抗原，部分喪失了系列專一性和分化的嚴(yán)格性。
用FCM檢測白血病免疫分型具有快速、簡便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。由于FCM可根據(jù)FSCνSSC直方圖區(qū)分細(xì)胞并可圈定檢測細(xì)胞范圍(Bitmap，無定型門),或用SSC(線性或?qū)?shù))和CD45直方圖圈定檢測細(xì)胞范圍(Bitmap，無定型門)，排除其他細(xì)胞干擾，因此較光學(xué)顯微鏡免疫熒光法或免疫組化法結(jié)果更準(zhǔn)確。
白血病免疫分型其臨床意義
目前公認(rèn)的系列特異性指標(biāo)是:T淋巴細(xì)胞系--胞漿CD3（cCD3）,B淋巴細(xì)胞系-- cCD22或cCD79，髓系---MPO 或cCD13,一般可先用他們區(qū)分細(xì)胞系列后再進(jìn)一步分析某一系列亞型和分化階段。
1. ALL的免疫學(xué)分型
1986年前分為普通型ALL（cALL）、未分化細(xì)胞ALL （Null-ALL）、T細(xì)胞ALL（ T-ALL） 、前B細(xì)胞ALL （PreB-ALL）、B細(xì)胞ALL （B-ALL）五型;1986-1994年分為兩大類九型(非T-ALL六型,T-ALL三型),九十年代后期有人按臨床實(shí)用性一般分為B祖細(xì)胞ALL、前B細(xì)胞ALL、B細(xì)胞ALL、T細(xì)胞ALL四型。表12.1-表12.4列出ALL的五型、九型（ B細(xì)胞系列六型、T細(xì)胞系列三型）、四型分類法。
B-祖細(xì)胞 ALL :B-祖細(xì)胞ALL 占兒童ALL的65%-70%,青少年ALL的55%-60%,成人ALL的50%,兒童ALL >90%病例 CD10+，而嬰兒CD10+病例<50%。FAB分類為L1、L2，白血病細(xì)胞的FS和SS都很低;一般TdT、HLA-DR、CD19陽性，大多數(shù)病例CD24、CD34陽性，本型細(xì)胞膜免疫球蛋白(Ig)陰性。此型有CD10+、CD10-兩個(gè)亞型，CD10+型預(yù)后較CD10-型好。
前B 細(xì)胞ALL ：前B 細(xì)胞ALL在發(fā)育階段上較B祖細(xì)胞 ALL晚，占兒童ALL的25%，在成人ALL占的比例還不清楚。一般CD24、HLA-DR、CD19、 CD10、cCD22陽性，CD34陰性,鑒別特點(diǎn)時(shí)有胞漿重鏈μ。此型預(yù)后較B祖細(xì)胞ALL差，可能與t(1;19)有關(guān)，t(1;19)占前B 細(xì)胞ALL的25%，此型CD34-，而B系列ALL中CD34-是獨(dú)立的預(yù)后不良標(biāo)記。
B細(xì)胞ALL ：B細(xì)胞ALL 占所有ALL 的2%-5%；B細(xì)胞ALL更為成熟，白血病細(xì)胞的FS和SS較B-祖細(xì)胞 ALL明顯增加，在FSνSS直方圖或SS(線性或?qū)?shù))νCD45直方圖中處于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞區(qū)域。典型標(biāo)記是細(xì)胞膜免疫球蛋白（sIg）陽性,表型一般為CD19、CD20、CD22、CD24陽性,多數(shù)病例CD10+，但sIg和成熟抗原出現(xiàn)可區(qū)別于更早的B系A(chǔ)LL。此型FAB分類一般為 L3,罕見病例有B細(xì)胞ALL標(biāo)記而FAB分類一般為 L1，這些病人多有t(1;19)和t(14;18)。
T細(xì)胞ALL ：T細(xì)胞ALL占兒童ALL的15%,成人ALL的25%。多數(shù)表型為胸腺細(xì)胞型，最常見的是晚期胸腺皮質(zhì)細(xì)胞亞型，CD1+、CD2+、CD5+、CD7+,CD4+CD8+，CD3表達(dá)較少，TdT常陽性；另一常見亞型是早期胸腺皮質(zhì)細(xì)胞亞型，CD2+、CD5+、CD7+、TdT+。髓質(zhì)期亞型較少見，CD2+、CD5+、CD7+，CD3+CD4+或CD3+CD8+，TdT表達(dá)較少。前T細(xì)胞亞型，僅有CD7和cCD3而無其他T系抗原表達(dá)，預(yù)后較差。T系腫瘤性疾病多有特異性正�？乖磉_(dá)的下調(diào)或表達(dá)該分化階段正常不應(yīng)出現(xiàn)的抗原。成人T細(xì)胞ALL預(yù)后較好，而兒童T細(xì)胞ALL較兒童B-祖細(xì)胞 ALL和前B細(xì)胞 ALL預(yù)后差，雖然各亞類預(yù)后仍不甚明確，但CD10陰性者預(yù)后不良。
ALL 的免疫學(xué)分型經(jīng)過1986年前分為五型，1986-1994年分為兩大類九型,九十年代后期(1997)分為四型的過程。1986年前的五型，是當(dāng)時(shí)單克隆抗體和檢測手段的反映；隨著新的單克隆抗體（主要是T、B淋巴細(xì)胞亞群的McAb）的發(fā)現(xiàn)和臨床大量病例的檢測，不僅弄清了T、B淋巴細(xì)胞的來源、分化發(fā)育過程，而且使免疫分型更加細(xì)致，因而出現(xiàn)了1986-1994年分為兩大類九型；但按照細(xì)胞的分化發(fā)育階段分型的兩大類九型分型法對臨床略顯繁瑣，指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后臨床實(shí)用性也不夠強(qiáng)，因此又出現(xiàn)了以上簡單的四型分類法。經(jīng)過對比不難看出，四型分類法的B-祖細(xì)胞ALL型實(shí)際上包含了兩大類九型分類法的非T-ALL的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3個(gè)亞型，而Ⅴ型即是前B 細(xì)胞ALL型，Ⅵ型是B 細(xì)胞ALL型；而T細(xì)胞ALL型是兩大類九型中T-ALL的三型合并為一型。兩大類九型分類法的非T-ALL的Ⅰ型分類為急性未分化白血�。ㄒ姾螅�。
ALL也可按DNA含量分類，用流式細(xì)胞儀很容易測定DNA含量，DNA含量分為兩個(gè)亞類：超二倍體和亞二倍體，前者預(yù)后好，后者預(yù)后差。
2.急性髓細(xì)胞白血病(AML)攪
目前所有粒、單核系的單克隆抗體基本無分化發(fā)育階段特異性,因此AML的免疫學(xué)分型FAB-M0、M1、M2界限不十分明顯;但M3多不表達(dá)HLA-DR和CD34，常表達(dá)CD13、CD33、CD9、CD38；GPA在鑒別紅白血病(M6)時(shí)可提供幫助;巨核細(xì)胞白血病(M7)則有CD41、CD42、CD61為系列特異標(biāo)記,為確診的重要指標(biāo)。由于白血病的異質(zhì)性,同一FAB分類的白血病抗原表達(dá)并不完全相同。AML的免疫表型見表12.5。
M0：M0白血病細(xì)胞的FS和SS都很低，在SSνCD45直方圖中處于原始淋巴細(xì)胞區(qū)域。M0的白血病細(xì)胞至少表達(dá)一個(gè)髓系特異性標(biāo)記如MPO、CD13、CD116，MPO較CD13、CD116更敏感；一般淋巴系標(biāo)記是陰性的，但可能表達(dá)CD7或CD4；一般CD34、HLA-DR陽性。有研究顯示AML復(fù)合表達(dá)CD7和CD34預(yù)后不良。
M1：M1的白血病細(xì)胞抗原表達(dá)類似于M0并與M0不好區(qū)分，M1一般表達(dá)CD13，CD33和HLA-DR，CD34表達(dá)較M0少，部分可能表達(dá)CD15，較少病人可能表達(dá)CD4。
M2：M2與M1的主要區(qū)別是分化成熟增加，原始細(xì)胞減少；CD34表達(dá)較M1少，CD15表達(dá)較M1增加，大部分病例HLA-DR陽性，CD13表達(dá)強(qiáng)于CD33；部分M2表達(dá)CD19和CD56伴有t(8;21)，罕見的伴有t(8;21)的M2不表達(dá)CD13，CD33和CD14但MPO陽性。
M3：M3白血病細(xì)胞由于它的高顆粒性而SS增大；M3的白血病細(xì)胞一般表達(dá)CD13，CD33，部分病人可能表達(dá)CD2，但HLA-DR陰性，CD34一般為陰性，復(fù)發(fā)病人陽性；部分病人可能表達(dá)CD56，表達(dá)CD56者應(yīng)作基因檢查(APL/RARα)以排外髓/NK細(xì)胞急性白血病(詳見后)。
M4、M5：M4、M5的免疫表型相似，重要表型特點(diǎn)是表達(dá)CD13、CD33、CD14、CD15和HLA-DR，部分病人表達(dá)CD4、CD7,部分病人可能表達(dá)CD56，表達(dá)CD2多為M4E0，常伴有16號染色體異常，預(yù)后好。
M6：M6較少見，一般表達(dá)HLA-DR、CD34、CD13、CD33，GPA對確定紅系有用。
M7：M7占成人ANLL的1%、兒童的4%。成人M7多見于二次性白血病,即CML.BC或MDS-RAEB或MF白血病變。而兒童M7多為原發(fā)。M7免疫學(xué)表型一般為:CD41+,CD42+,CD61+,CD33+/-,CD13+/-,CD34+,DR+/-,CD10-。特異性標(biāo)記CD41、CD42、CD61陽性可確診M7，但要注意排外血小板粘附于細(xì)胞上的假陽性結(jié)果。
3．急性未分化白血病 用流式細(xì)胞儀分析僅有大約1%的急性白血病不能分類，典型急性未分化白血病僅有HLA-DR和CD34表達(dá)而無系列特異性抗原表達(dá)。
4．雜合型白血病 真正的雙系列表型白血病是伴有t(9;22)或有11q23 MLL（myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia髓/淋系或混合性白血�。┗蛑嘏诺牟∪耍酝鶊�(bào)道的許多雜合型白血病多是由于方法學(xué)問題不能排除非白血病細(xì)胞的干擾，或?qū)⒎翘禺惾醣磉_(dá)當(dāng)作特異表達(dá)，如前所述白血病細(xì)胞畢竟不是正常造血細(xì)胞,其抗原表達(dá)與正常造血細(xì)胞并不完全相同，部分喪失了系列專一性和分化的嚴(yán)格性，因此不要輕易定型雜合型白血病，國際上雜合型白血病尚無統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)。
5．慢性粒細(xì)胞白血病急性變(CML BC) 慢性粒細(xì)胞白血病(慢粒 CML)是一種多能造血干細(xì)胞疾病,其轉(zhuǎn)歸多為急性變。慢粒急變(CML BC)涉及所有造血細(xì)胞系列,往往不易從形態(tài)學(xué)上確定急變類型, 50%-60%為AML變,30%左右為ALL變。AML變可表達(dá)AML的所有表型，大多數(shù)ALL變?yōu)锽細(xì)胞來源,其中cALL及前B-ALL多見,罕見T-ALL變。
6．B 淋巴系細(xì)胞增殖性疾病 B 淋巴系細(xì)胞增殖性疾病的免疫學(xué)分型見表12.6。采自C.D Jennings and K A.Foon略加改變. MCL: mantle cell 淋巴瘤; FCCL:Follicular center cell lymphoma---瀘泡中心細(xì)胞淋巴瘤; MZL: Marginal zone lymphoma—邊緣區(qū)淋巴瘤; SLL:small cell lymphocyte lymphoma--小細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤
B 淋巴系細(xì)胞增殖性疾病中包括B慢性淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)、B幼淋細(xì)胞白血病（B-PLL）、毛細(xì)胞白血病（HCL）和多發(fā)性骨髓瘤（MM）/漿細(xì)胞白血病和部分淋巴瘤，淋巴瘤免疫分型將在不同章節(jié)中描述。
B-CLL：B-CLL的白血病細(xì)胞一般表達(dá)CD19、CD20、CD43和CD79a，CD5與以上抗原復(fù)合表達(dá)，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達(dá)但表達(dá)較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預(yù)后較差。
B-PLL ：流式細(xì)胞儀在區(qū)分B-PLL和B-CLL中十分有用, B-PLL通常sIg表達(dá)強(qiáng), CD5陰性而CD22陽性,困難的是原發(fā)B-PLL和由B-CLL轉(zhuǎn)化為B-PLL的區(qū)分, 由B-CLL轉(zhuǎn)化來的B-PLL CD5陽性而CD22表達(dá)弱,類似于B-CLL。
HCL：HCL 一般表達(dá)成熟B細(xì)胞標(biāo)記:CD20、CD22、CD19、CD79、sIg，CD11c、CD22高表達(dá)，CD25中等度以上表達(dá)，一般CD21-，典型病例CD5-、CD10-、CD23-，但有少數(shù)病例可陽性。CD103是HCL最可信的標(biāo)記，可用來與其它B細(xì)胞白血病鑒別。
漿細(xì)胞瘤：由于大多數(shù)多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓標(biāo)本中含骨髓瘤細(xì)胞少及瘤細(xì)胞喪失了大多數(shù)B細(xì)胞系特異性標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀分析多發(fā)性骨髓瘤（MM）/漿細(xì)胞白血病較為困難，典型的漿細(xì)胞CD38強(qiáng)表達(dá)而CD45弱表達(dá)。一般漿細(xì)胞sIg弱表達(dá),cIg陽性。
7．T淋巴系細(xì)胞增殖性疾病 T淋巴系細(xì)胞增殖性疾病的免疫學(xué)分型見表12.7。
T淋巴系細(xì)胞增殖性疾病中包括T幼淋細(xì)胞白血病（T -PLL）、NK細(xì)胞白血�。═-LGL、NK-LGL）和成人T淋巴細(xì)胞白血�。ˋTL）、T慢性淋巴細(xì)胞白血病(T-CLL)。
T-PLL ：T-PLL的白血病細(xì)胞一般表達(dá)CD2、CD3、CD5和CD7，大多數(shù)病人CD4+ CD8-,但偶有CD4+ CD8+,單獨(dú)表達(dá)CD8者少見, 本病常伴有14q11和14q32改變, 有CD4+ CD8-表型者預(yù)后較好,本病較B-PLL惡性度高。
NK 細(xì)胞白血病 ：NK系列白血病最早描述的是大顆粒淋巴細(xì)胞白血病（LGL）, LGL有兩種類型：T-LGL和NK-LGL，T-LGL表達(dá)CD3、CD8、CD2、CD16、CD11b、CD57、而CD56、CD5、CD7、CD4和CD25多陰性，有TCR基因重排。NK-LGL表達(dá)CD2、CD16和CD56，而CD3、CD4多陰性，CD8、和CD57弱表達(dá)或陰性，無TCRα-β基因重排。最近NK系列白血病又有新的亞型發(fā)現(xiàn)，如急性前髓系/NK 細(xì)胞白血病、急性髓系/NK 細(xì)胞白血病、原始NK 細(xì)胞白血病、NK樣T細(xì)胞白血病。急性前髓系/NK 細(xì)胞白血病是一種最近認(rèn)識(shí)的不同類型的白血病, 其特點(diǎn)是有明顯髓外涉及,不成熟的原始淋巴細(xì)胞樣形態(tài),伴MPO--、CD7+、 CD33+/CD13+、sCD3-、cCD3-、CD56+,預(yù)后不良。急性髓系/NK 細(xì)胞白血病，形態(tài)學(xué)和免疫表型類似于M3,但無RARα基因重排，一般HLA-DR-、CD33+、CD13+、CD56+，多見于老年病人，對維甲酸無反應(yīng)。原始NK 細(xì)胞白血病，無髓系和淋巴系抗原，CD56+、cCD3+/-、CD2+/-、CD4+/-、CD7+/-，少數(shù)有TCRβ基因重排，而無TCRγ-δ基因重排。NK細(xì)胞系列白血病的新亞型是近10年才較多注意到的白血病,其臨床特點(diǎn),免疫表型,染色體及基因改變需進(jìn)一步積累病例研究才能徹底明了。大約10%-20%左右的急性白血病表達(dá)CD56，除了原始NK 細(xì)胞白血病、NK樣T細(xì)胞白血病、急性髓系/NK 細(xì)胞白血病、急性前髓系/NK 細(xì)胞白血病外，大部分表達(dá)CD56的急性白血病是FAB分類的M2、M3、M4、M5型，這類病人究竟是急性髓系/NK 細(xì)胞白血病還是急性髓系細(xì)胞白血病伴NK抗原表達(dá)有待進(jìn)一步研究，鑒于急性白血病部分喪失了系列專一性和分化的嚴(yán)格性，可能稱為急性髓系細(xì)胞白血病伴NK細(xì)胞抗原表達(dá)較為合適。
成人T淋巴細(xì)胞白血病(ATL)：大多數(shù)ATL細(xì)胞表達(dá)激活T細(xì)胞表型：CD3、CD4、CD5、CD25、HLA-DR、TCR，一般CD7-和CD8-,常有粘附分子L-選擇素的異常表達(dá)； 伴有p53異常者預(yù)后不良。
T-CLL：T-CLL少于CLL總數(shù)的1%，細(xì)胞形態(tài)學(xué)類似與一般CLL，但臨床發(fā)展較快，但多數(shù)病人表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、少數(shù)病人表達(dá)CD8。
淋巴瘤免疫分型
目前淋巴瘤的分類方法已從LSG的形態(tài)學(xué)分類逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镽EAL分類法, REAL分類法是以腫瘤發(fā)生源為基礎(chǔ)的分類方法,在原來的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上加上免疫學(xué)分型后再加以分類,這種分類方法不僅能夠推斷腫瘤的發(fā)生源,對治療也有指導(dǎo)意義。因此淋巴瘤的免疫分型越來越重要。如同白血病免疫分型一樣，淋巴瘤的免疫分型也是利用單克隆抗體檢測淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原,分析其表現(xiàn)型,以了解被測淋巴瘤細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。流式細(xì)胞儀能對多數(shù)的淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿抗原迅速客觀地做出檢測，在淋巴瘤的免疫分型中起著不可替代的作用。
臨床淋巴瘤的免疫分型的檢測標(biāo)本一般是淋巴結(jié)、脾臟、胸水、腹水等。在臨床淋巴瘤的免疫分型工作中�？捎龅揭韵滤姆N情況：①B細(xì)胞系淋巴瘤②T/NK細(xì)胞系淋巴瘤③淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤④造血細(xì)胞以外的腫瘤。
REAL分類淋巴瘤的免疫表型見表12.8。*：弱表達(dá)或陰性。
BLBL :前B原始淋巴細(xì)胞淋巴瘤/白血病; BSLL: B-小淋巴細(xì)胞淋巴瘤; LPL:淋巴漿細(xì)胞樣淋巴瘤; MCL: 斗篷細(xì)胞淋巴瘤; FCL:濾泡中心淋巴瘤; MZL: 邊緣帶B細(xì)胞淋巴瘤; SMZL :脾MZL ;HCL:毛細(xì)胞白血病; PC:漿細(xì)胞瘤;DLBL: B-彌漫性大細(xì)胞淋巴瘤; BL: Burkitts淋巴瘤; HBLB:高度B細(xì)胞淋巴瘤, Burkitts樣; TLB L: 前T原始淋巴細(xì)胞淋巴瘤/白血病; TPLL: T幼淋細(xì)胞白血病; LGLT:大顆粒淋巴細(xì)胞白血病, T細(xì)胞型; LGLNK: 大顆粒淋巴細(xì)胞白血病, NK細(xì)胞型; MF:覃樣真菌病; PTL:外周T細(xì)胞淋巴瘤,非特異;AILD:血管免疫T細(xì)胞淋巴瘤;ACL:血管中心性淋巴瘤; ITCL:腸T細(xì)胞淋巴瘤; ATL:成人T細(xì)胞淋巴瘤/白血病; LCL:大細(xì)胞淋巴瘤; LCLH: 大細(xì)胞淋巴瘤,何杰金氏樣;
1． B細(xì)胞系淋巴瘤 大多數(shù)情況下, B細(xì)胞系淋巴瘤CD19、CD20陽性，分化早期CD20陰性，CD10、CD34陽性；分化晚期CD5、CD23陽性，成熟為漿細(xì)胞后以上標(biāo)記均陰性。利用單克隆抗體κ、λ（正常時(shí)κ：λ=2：1）可檢測免疫球蛋白輕鏈的偏移，推斷是否克隆性增殖免疫球蛋白。表12.6. 列出了外周B 淋巴系淋巴瘤的4種類型的免疫分型。
SLL(small cell lymphocyte lymphoma)--小細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤: 小細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞一般表達(dá)CD19、CD20、CD43和CD79，CD5與以上抗原復(fù)合表達(dá)，sIgM、sIgD、CD11c和CD25也常表達(dá)但表達(dá)較弱，CD10、CD22陰性。伴染色體異常者預(yù)后較差。
MCL（mantle cell lymphoma）--斗篷細(xì)胞淋巴瘤：MCL包括以前分類為中等淋巴細(xì)胞淋巴瘤（ILL）、中度分化淋巴細(xì)胞淋巴瘤(IDL)、中心細(xì)胞淋巴瘤和套區(qū)細(xì)胞淋巴瘤（MZL）,占淋巴瘤的2%-8%，λ型較κ型常見， sIgM中度表達(dá),IgD弱或陰性，表達(dá)CD19、CD20、CD22、CD43，但多數(shù)病例CD5陽性CD23陰性，CD10一般陰性，CD5陽性CD23陰性和Ig類型可幫助鑒別MCL和FCL。
FCL（Follicular center cell lymphoma）---瀘泡中心細(xì)胞淋巴瘤：FCL占淋巴瘤的45%，表達(dá)CD19、CD20、CD22， sIg強(qiáng)表達(dá),但多數(shù)病例CD10和CD23陽性，典型FCCL CD5、CD43和CD11c陰性。CD10陽性、CD11c陰性和sIg強(qiáng)表達(dá)利于與MZL鑒別。
MZL（Marginal zone lymphoma）--邊緣帶淋巴瘤和相關(guān)B 細(xì)胞淋巴瘤：典型免疫表型: CD19、CD20、CD22、HLA-DR陽性，sIg中度表達(dá)，CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，多數(shù)表達(dá)CD11c。CD5、CD10、CD23、CD25陰性，CD21、CD24多數(shù)情況下陰性，利于與CLL/SLL、FCCL、MZL鑒別。
2． T/NK細(xì)胞系淋巴瘤 早期T細(xì)胞一般CD2、CD5、CD7、cCD3陽性。T/NK細(xì)胞系淋巴瘤的詳細(xì)分類及表型參見表12.8。細(xì)胞膜CD3陽性可確認(rèn)為外周T細(xì)胞腫瘤, 外周T細(xì)胞腫瘤的特征是CD3與CD4或CD8復(fù)合表達(dá)，并常有克隆性T細(xì)胞受體，或α-β型或γ-δ型；
MF（mycosis fungoides）--蕈樣真菌病和sezary綜合癥:占皮膚淋巴瘤的絕大多數(shù)，CD4陽性，同時(shí)表達(dá)CD2、CD3、CD5，有時(shí)CD7陰性，CD8陽性病例極少見但已有報(bào)道，有無TCRβ基因重排對鑒別淋巴瘤和炎性反應(yīng)有幫助。
LCL（large cell lymphoma）--大細(xì)胞淋巴瘤: 大細(xì)胞淋巴瘤（LCL）占成人淋巴瘤的40%，兒童的1/3，成人80%是B細(xì)胞型的，兒童B細(xì)胞型和T細(xì)胞型各占一半。
3． 淋巴細(xì)胞系以外的造血細(xì)胞腫瘤 急性髓系細(xì)胞白血病（特別是M4、M5）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)有發(fā)生，如T、B淋巴細(xì)胞標(biāo)記低表達(dá)應(yīng)懷疑并按白血病免疫分型處理。
4． 造血細(xì)胞以外的腫瘤 檢測淋巴結(jié)、胸腹水標(biāo)本時(shí)如遇CD45陰性情況應(yīng)考慮非造血系統(tǒng)腫瘤淋巴結(jié)、胸膜、腹膜轉(zhuǎn)移。
紅細(xì)胞疾病診斷
（一）網(wǎng)織紅細(xì)胞測定
計(jì)數(shù)外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量,對于評價(jià)骨髓紅系造血及網(wǎng)織紅細(xì)胞從骨髓到外周血的轉(zhuǎn)送速率有重要意義。有核紅細(xì)胞在成熟過程中,脫去細(xì)胞核后仍有少量RNA殘留在細(xì)胞漿內(nèi),再經(jīng)過約一天時(shí)間殘留RNA完全消失,成為成熟紅細(xì)胞。這種細(xì)胞漿內(nèi)有殘留RNA的紅細(xì)胞稱作網(wǎng)織紅細(xì)胞。正常情況下有一定量的網(wǎng)織紅細(xì)胞出現(xiàn)在外周血中,正常值為1.0～1.5%,上限3.0%,但當(dāng)紅細(xì)胞數(shù)異常時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。因此用網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對值表示,正常值5～15×1010/L。由于常規(guī)方法測定須先在體外經(jīng)活體染色(最常用亞甲蘭),然后在顯微鏡下計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)有限。用流式細(xì)胞儀測定網(wǎng)織紅細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn):①可避免由于細(xì)胞核的碎片或鐵幼粒細(xì)胞的顆粒的存在而出現(xiàn)假性網(wǎng)織紅細(xì)胞升高②可避免人為誤差③因?yàn)榭稍诙虝r(shí)間內(nèi)測量上萬個(gè)細(xì)胞,結(jié)果較常規(guī)方法準(zhǔn)確、可靠,④同時(shí)可給出網(wǎng)織紅細(xì)胞年齡結(jié)構(gòu)。
流式細(xì)胞儀測定網(wǎng)織紅細(xì)胞方法簡單,只須將紅細(xì)胞洗凈后用熒光染料染色后即可上機(jī)檢測。常用的熒光染料有焦寧Y(Pyronin Y) 丫啶橙(Acridine OrangeAO) 碘化丙啶(崐Propidium Iodine PI) 花青( Cyanine dye)等。
（二）PNH診斷
陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）因血細(xì)胞膜上錨固蛋白-糖磷酸肌醇（GPI）減少或缺乏而導(dǎo)致與GPI有關(guān)的補(bǔ)體激活抑制因子如CD55、CD59減少或缺乏，因而紅細(xì)胞對補(bǔ)體異常敏感發(fā)生溶血。流式細(xì)胞儀檢查CD55、CD59十分敏感，正常人CD55、CD59雙陽性細(xì)胞>95%，PNH病人CD55、CD59明顯減少，這種減少不僅表現(xiàn)在紅細(xì)胞上，粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也有減少。已發(fā)現(xiàn)CD55c可能對GPI減少或缺乏較CD59更敏感。
血小板功能分析和血小板病診斷
（一） 血小板功能分析
血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期血小板的膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同，用不同的抗血小板單克隆抗體可測定和分析血小板功能狀態(tài)。血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41(GPIIb/IIIa)、CD61(GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、CD41b (GPIIb)、血小板顆粒膜糖蛋白CD62p、CD63的測定可供分析血小板功能狀態(tài)，如CD62p、CD63正常血小板不表達(dá)，當(dāng)血小板活化時(shí)表達(dá)明顯增加，可用來測定活化血小板。
（二）血小板病診斷攪
1．血小板相關(guān)抗體測定 血小板相關(guān)抗體可因不同機(jī)制產(chǎn)生。抗血小板自身抗體(包括原發(fā)性、藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生、合并其它自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)能引起嚴(yán)重的血小板減少。大多數(shù)原發(fā)性(免疫性)血小板減少性紫癜病人血小板上和/或血清中有抗自身血小板的血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM。血小板相關(guān)抗體的抗原仍不十分清楚,可能有多種,如GPⅠb、GPⅡb 、GPⅢa、Pa、或HLA抗原。抗血小板自身抗體也可能發(fā)生于多次輸血后或懷孕期間,這些自身抗體多為針對HLA-Ⅰ類抗原決定簇的抗體,一般是IgG,它們可迅速破壞和清除隨機(jī)供血者的血小板。因此能迅速測定這些抗體存在與否的方法是必需的。許多不同的利用放免、熒光、酶、SPA等的測定血小板抗體的方法已建立,但這些方法都很復(fù)雜、費(fèi)時(shí);同時(shí)給出的結(jié)果只能以一定量的血小板(105)中有多少抗血小板抗體來表示。近年來發(fā)展起來的用FCM測定血小板抗體的方法具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn),同時(shí)可測定血小板上和血清中的抗體;測定中FCM分析每一個(gè)血小板表面有無抗體,能給出血小板群體中有多少血小板表面有抗體(以%表示);同時(shí)能給出血小板相關(guān)抗體量與血小板數(shù)的直方圖,使我們了解血小板相關(guān)抗體在血小板群體中的分布情況。
FCM測定血小板抗體原理:分別用標(biāo)有熒光的抗人IgG、IgA、IgM或用抗血小板GPⅠb、Ⅱb、Ⅱb/Ⅲa的抗體與分離洗凈的病人的血小板和在病人血清中孵育過的正常O型血小板作用后用FCM測定,前者測定的是病人血小板上的抗體后者測定的是病人血清中的抗體。
2．血小板無力癥 血小板無力癥時(shí)血小板膜GPIIb/IIIa明顯減少，用血小板質(zhì)膜糖蛋白單克隆抗體CD41、CD61和流式細(xì)胞儀測定不僅可測出GPIIb/IIIa減少，CD42a、CD42b基本正�；蚱撸�可測出GPIIb/IIIa減少程度，分類血小板無力癥。
3.巨大血小板綜合征（BSS）:血小板巨大, CD42a減少，CD42b減少，CD61 增加。
微小殘留白血病檢測
微小殘留白血病(Minimal Residual Leukemia MRL)是指白血病經(jīng)治療后獲得完全緩解(Complete Remisson CR)后體內(nèi)殘留少量白血病細(xì)胞的狀態(tài)。微小殘留白血病與明顯白血病(Overt leukemia)無明確界限,僅是白血病細(xì)胞負(fù)荷數(shù)量不同,一般成人明顯白血病時(shí)白血病細(xì)胞可達(dá)1012,經(jīng)治療獲CR后≤1010,因此MRL狀態(tài)白血病細(xì)胞數(shù)可能是100-10攪。MRL是白血病復(fù)發(fā)的根源,因此檢測MRL有十分重要的意義: ①指導(dǎo)臨床治療②預(yù)測白血病復(fù)發(fā)③評價(jià)自體骨髓移植的凈化效果。應(yīng)用FCM檢測MRL的優(yōu)點(diǎn)在于可在短時(shí)間內(nèi)分析大量標(biāo)本,具有快速的特點(diǎn)。
由于白血病細(xì)胞缺乏特異性標(biāo)記,FCM檢測MRL的效果尚不理想,敏感性尚不夠高，一般僅有1/103-104。目前主要有兩類檢測方法: ①用FCM分析CR期骨髓細(xì)胞核酸量或染色體,可用于部分AL病人MRL分析,但敏感性僅1-5%。②免疫表型分析,由于尚無白血病特異的標(biāo)記,只能通過與正常細(xì)胞比較某些抗原量的差別及分布部位的不同作為檢測依據(jù);如利用TdT和CD10雙標(biāo)記檢測MRL,但敏感性亦不高,約0.1-1%。
假陰性結(jié)果可能由于: ①標(biāo)本中的白血病細(xì)胞＜10-4攪或＜10-5;②所取標(biāo)本不能代表全身骨髓情況; ③病人白血病細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換。
白細(xì)胞吞噬功能測定
粒、單核-巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞中的重要成員。它們不僅具有吞噬功能,吞噬外來的微生物、腫瘤細(xì)胞等,同時(shí)又分泌多種生物因子參于免疫反應(yīng),此外單核-巨噬細(xì)胞對抗原物質(zhì)的攝取、修飾、遞呈等作用,是淋巴細(xì)胞的免疫功能必不可少的。因此檢測白細(xì)胞吞噬功能對了解機(jī)體免疫狀況有重要意義。以下簡要介紹FCM測定白細(xì)胞吞噬功能的概況。
應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡測定白細(xì)胞吞噬功能時(shí)須分離粒、單核細(xì)胞, 并盡可能地保持細(xì)胞活性。用FCM檢測時(shí)不須分離細(xì)胞,應(yīng)用全血即可, 因此可在自然狀態(tài)下測定,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
目標(biāo)粒子一般以酵母、細(xì)菌等能激發(fā)自然吞噬作用或予先以抗體調(diào)理化的人造粒子為好;并標(biāo)以熒光,常用者為FITC(異硫氰酸熒光素)或RA(羅達(dá)明).
以肝素或拘櫞酸抗凝取外周血(避免用EDTA),200μl全血與目標(biāo)粒子200μl(目標(biāo)粒子濃度4×107/ml)置37°C溫育,溫育結(jié)束后立即置冰水中, 以同樣標(biāo)本不在37°C溫育而置于冰水中者作為對照。目標(biāo)粒子不同溫育時(shí)間不一,FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌25分鐘,FITC標(biāo)記的粒子15分鐘即可達(dá)到吞噬飽和;此外,粒子與白細(xì)胞的比例也很重要,一般為10:1。溫育結(jié)束后以溶血?jiǎng)┤苋ゼt細(xì)胞即可上機(jī)檢測。
應(yīng)用FCM全血法測定白細(xì)胞吞噬功能,對白細(xì)胞的丟失、損傷最小;此外用本法可測定血清中的調(diào)理素(Opsonine)水平及血清中有無吞噬作用抑制因子。如果用FITC標(biāo)記的單克隆抗體 CD13、CD14、CD15標(biāo)記粒、單核細(xì)胞,用紅熒光標(biāo)記目標(biāo)粒子,即可測定吞噬功能與細(xì)胞表面標(biāo)記的關(guān)系,對白細(xì)胞吞噬功能作進(jìn)一步的研究。
NK和LAK細(xì)胞活性測定
NK細(xì)胞存在于外周血大顆粒淋巴細(xì)胞中,它對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性不依賴于抗體,無MHC限制性,它們的數(shù)量及細(xì)胞毒活性是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要指標(biāo)。人NK細(xì)胞一般表達(dá)CD56、CD16、CD57部分表達(dá)CD2、CD8、CD11而不表達(dá)CD3。
LAK(Lymphokine Activated Killer cells)細(xì)胞主要存在于LGL的高密度群體中,LAK前體細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)志CD16而不表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)志如CD3、CD4、CD5等;它們不需要抗原刺激就能殺傷NK細(xì)胞不能殺傷的腫瘤細(xì)胞,并且無MHC限制性;從表型上看大多數(shù)LAK細(xì)胞來自NK細(xì)胞,但嚴(yán)格講LAK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性不能稱作LAK活性,測定LAK活性的靶細(xì)胞應(yīng)為NK抵抗的實(shí)體瘤細(xì)胞,如HL-60細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等。
常用的測定NK和LAK細(xì)胞活性的方法較多,如攩51Cr釋放法、[3H]TdR參入法或釋放法、LDH釋放法、ATP發(fā)光法等;應(yīng)用放射性同位素對人體和環(huán)境不利,利用FCM測定NK和LAK細(xì)胞活性從1986年就開始摸索,方法已趨于成熟,以下介紹其中一種:
肝素抗凝取外周血后分離PBMC后洗凈,調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml,為效應(yīng)細(xì)胞;靶細(xì)胞分別為K562和HL-60或HeLa細(xì)胞,在對數(shù)生長期受集細(xì)胞,調(diào)整濃度為106。用3mMDiO(3,3-Diacradecyloxacarbocyanine Perchlorate)標(biāo)記靶細(xì)胞,效應(yīng)細(xì)胞:靶細(xì)胞(E:T)為40:1、20:1、10:1和5:1,孵育后加入PI(10μg/ml)染死細(xì)胞,洗凈后即可上機(jī)檢測。DiO發(fā)綠熒光,PI發(fā)紅熒光,利用雙參數(shù)(FL1vFL2)直方圖可清楚地了解靶細(xì)胞中的死亡細(xì)胞,計(jì)算出靶細(xì)胞%溶解率。
造血干/祖細(xì)胞測定
造血干/祖細(xì)胞移植已廣泛應(yīng)用于血液腫瘤、實(shí)體瘤、某些遺傳性疾病、免疫缺陷病等，因此檢測造血干/祖細(xì)胞已成為臨床必不可少的手段。應(yīng)用流式細(xì)胞儀多色技術(shù)測定外周血造血干/祖細(xì)胞，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，不僅能確定造血細(xì)胞數(shù)量，而且能對造血干祖細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，為臨床干細(xì)胞移植治療提供重要數(shù)據(jù)。目前多色組合一般包括CD34、CD38、HLA-DR等McAb。
CD34抗原是一種分子量約11萬的糖蛋白，選擇性地表達(dá)于早期造血干/祖細(xì)胞、小血管內(nèi)皮細(xì)胞和胚胎纖維母細(xì)胞表面。該抗原在原始造血細(xì)胞上表達(dá)，以后隨細(xì)胞分化、成熟逐漸減少直至消失，因此一直作為造血干/祖細(xì)胞表面的一種特征性標(biāo)志而廣泛應(yīng)用于造血干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和臨床。CD34+細(xì)胞是一群不均一的群體，依其是否表達(dá)CD38、HLA-DR、CD33、c-kit等分出的亞群表現(xiàn)出了不同的造血性能。最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細(xì)胞究竟是否都是CD34+細(xì)胞出現(xiàn)一些爭論,實(shí)驗(yàn)研究證明, CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞更具造血潛能,有人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究提出CD34的表達(dá)與造血干細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)相關(guān),細(xì)胞激活時(shí)CD34+,細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)CD34-;也有人提出CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞發(fā)育階段更早。我們認(rèn)為：成人體內(nèi)可能仍保留著一小部分原始間充質(zhì)細(xì)胞，他們?nèi)员Ａ糁嘞蚍只芰Γ材芟蛟煅杉?xì)胞分化，因此體內(nèi)有CD34-造血干細(xì)胞和CD34+造血干細(xì)胞是正常的，CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞發(fā)育階段更早、更具造血潛能；但目前的用CD34+細(xì)胞代表造血干細(xì)胞的檢查方法已足以滿足臨床需要，因?yàn)榕R床實(shí)踐已證明這一點(diǎn)。理論研究往往能推動(dòng)學(xué)術(shù)發(fā)展，開發(fā)新技術(shù)，我們期待著造血理論的不斷發(fā)展給臨床帶來新技術(shù)，不斷提高臨床療效。
我們用CD34、CD38、HLA-DR三色組合測定了151份外周血經(jīng)動(dòng)員后標(biāo)本，CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞（MNC）的（0.954±0.466）%，含量為（3.55±2.41）×109/L；其中CD34+CD38-亞群含量為（0.253±0.24）×109/L，占CD34+細(xì)胞的7.13%；CD34+HLA-DR-亞群含量為（0.273±0.310）×109/L，占CD34+細(xì)胞的7.61%；隨著采集次數(shù)的增加，CD34+細(xì)胞及其亞群數(shù)量逐漸減少（P＜0.05）；隨著供者年齡增加，其外周血CD34+細(xì)胞數(shù)逐漸減少，在≥40歲供者CD34+細(xì)胞百分比和含量比＜20歲供者分別降低了47%和50%；動(dòng)員后外周血CD34+細(xì)胞數(shù)存在性別差異，男性供者外周血CD34+細(xì)胞數(shù)較女性高23%。
應(yīng)用流式細(xì)胞儀測定造血干細(xì)胞雖具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，目前被廣泛采用。但應(yīng)用中要特別重視質(zhì)量控制，要建立一套完整質(zhì)控方法以確保檢測的準(zhǔn)確性。
細(xì)胞凋亡研究
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，因而研究細(xì)胞凋亡有重要意義。細(xì)胞凋亡檢測方法很多，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞在凋亡過程中發(fā)生一系列形態(tài)、生化變化從多個(gè)角度對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量的測定。
1. 細(xì)胞形態(tài)變化：通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化來觀察細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞前向角光散射的能力顯著降低，90°角光散射的能力增加；在細(xì)胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信號均降低。此方法特異性不強(qiáng)，目前使用較少。
2 細(xì)胞膜功能改變：
（1） 磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine PS）異位：正常情況下，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。PS與Annexin Ⅴ（一種具有強(qiáng)力抗凝作用的血管蛋白）具有高度親和力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀采用FITC- Annexin Ⅴ/PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，可同時(shí)描述三群不同狀態(tài)細(xì)胞：FITC- Annexin Ⅴ-/PI-細(xì)胞，即正�；盍�(xì)胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI-細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞；FITC- Annexin Ⅴ+/PI+細(xì)胞，即已死亡細(xì)胞。此種方法操作過程簡單，指標(biāo)敏感，應(yīng)用者越來越多。
（2） PI/Hoechst33342雙染法：Hoechst33342（HO）是一種DNA的特異性熒光染料，可通過完整細(xì)胞膜，應(yīng)用PI/Hoechst33342可將細(xì)胞分為三群：正�；罴�(xì)胞（HO強(qiáng)/ PI-），凋亡細(xì)胞（HO弱/ PI-），（由于凋亡細(xì)胞發(fā)生DNA降解和丟失，導(dǎo)致HO熒光減弱），死亡細(xì)胞（HO弱/ PI+）。此種方法再結(jié)合凋亡細(xì)胞前向角光散射能力降低的特點(diǎn)，能更好地鑒定凋亡細(xì)胞，但HO須紫外光激發(fā)，由于很多流式細(xì)胞儀不配有紫外激光，故此法應(yīng)用受限。
（3） 吖啶橙(AO)/溴化乙啶(EB)雙染法: AO是一種異染性熒光染料,可通過完整的質(zhì)膜,它與核酸的結(jié)合主要是嵌入DNA雙鏈的堿基之間，其發(fā)射峰為530nm，呈綠色熒光。EB的理化特性與PI相似，不能通過完整質(zhì)膜。應(yīng)用AO/EB雙染法也可以將細(xì)胞分成三群：正常活細(xì)胞（AO強(qiáng)/ EB -），凋亡細(xì)胞（AO弱/ EB -），死亡細(xì)胞（AO弱/ EB +），原理與PI/Hoechst33342雙染法相似，不同的是AO/EB雙染法所的激發(fā)光是被廣泛使用的氬激光（488nm），而不須紫外光，其缺點(diǎn)是染色過程較復(fù)雜，且AO易污染設(shè)備管道，因此使用此法者較少。
（4） 放線菌素D(7-AAD)染色法：7-AAD是一種核酸染料，它不能通過正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過程，質(zhì)膜對7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA的有控降解，最后通過7-AAD標(biāo)記DNA的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正�；盍�(xì)胞。此法具有染色快速、簡便、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。另外，由于此法不破壞細(xì)胞膜，故還可聯(lián)合使用FITC、PE標(biāo)記的膜蛋白,對特殊細(xì)胞群及亞群進(jìn)行多色熒光分析(雖然AO/EB雙染法也不破壞被檢細(xì)胞膜,但由于AO及EB的發(fā)射光波譜分別與FITC和PE的發(fā)射光波譜相似，故AO/EB法不能與FITC和或PE聯(lián)合使用)。此法是應(yīng)用核酸染料測定細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀法中十分實(shí)用的方法。
3. 細(xì)胞器改變： 線粒體膜APO2.7蛋白表達(dá)：早期凋亡細(xì)胞的線粒體膜出現(xiàn)APO2.7蛋白表達(dá)，利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)可以檢測早期凋亡細(xì)胞。
4 .DNA含量變化：
主要是PI染色法，由于凋亡細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細(xì)胞膜（經(jīng)乙醇及透膜劑處理）漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量直方圖中G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即所謂凋亡峰。通過測定凋亡峰百分含量，便可知凋亡細(xì)胞比例。此法簡便、快速，是目前常用的、經(jīng)典的測量凋亡細(xì)胞的方法。此法存在問題：少量的正常的低DNA含量細(xì)胞、由于機(jī)械損傷產(chǎn)生DNA含量減低的壞死細(xì)胞、染色體丟失的分裂相細(xì)胞以及細(xì)胞碎片和微核等都可能出現(xiàn)在亞二倍體峰內(nèi)。因此，此法的特異性較低。
5. DNA斷裂點(diǎn)標(biāo)記：細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生DNA斷裂,利用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可以將dUTP標(biāo)記到斷裂點(diǎn)上,稱作原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）技術(shù)。此法有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種，前者的標(biāo)記物是FITC-dUTP，后者的標(biāo)記物是生物素(biotin)標(biāo)記的dUTP,需要再用FITC標(biāo)記的親和素(avidin)與生物素標(biāo)記的dUTP結(jié)合，使標(biāo)記反應(yīng)倍增，故間接標(biāo)記法靈敏度高，但操作較復(fù)雜。TUNEL還可以配合其它單抗同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞表型分析，或與DNA含量同時(shí)分析。TUNEL法因其靈敏度高而被廣泛采用。
6 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因產(chǎn)物檢測：細(xì)胞凋亡是一個(gè)多種基因參與的復(fù)雜過程,目前已知與bcl-2基因、c-myc基因、P53基因等有關(guān)，這些基因都有相關(guān)產(chǎn)物，目前針對這些相關(guān)產(chǎn)物已有單克隆抗體生產(chǎn)，應(yīng)用這些單抗，通過流式細(xì)胞儀可檢測造血細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平，相互關(guān)系。
流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡方法、層次眾多，且具有快速、準(zhǔn)確特點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛。在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意采用多種方法結(jié)合使用，使結(jié)果更加可靠準(zhǔn)確。
細(xì)胞分選
流式細(xì)胞儀能夠分選某一亞群細(xì)胞,分選純度＞95%。目前細(xì)胞分選主要用于研究，臨床應(yīng)用較少。血液學(xué)應(yīng)用最多的是造血干細(xì)胞的研究，最近隨著造血理論的深入研究關(guān)于造血干細(xì)胞究竟是否都是CD34+細(xì)胞出現(xiàn)一些爭論,實(shí)驗(yàn)研究證明, CD34-造血干細(xì)胞較CD34+造血干細(xì)胞更具造血潛能,這些實(shí)驗(yàn)研究所用的CD34- 和CD34+細(xì)胞就是通過細(xì)胞分選獲得的。小鼠造血干細(xì)胞分選一般按lin-c-Kit+CD34+/ lin-c-Kit+CD34-分選,人造血干細(xì)胞分選一般按lin-CD34+/ lin-CD34-分選。
為避免某些遺傳性血液病如海洋性貧血、異常血紅蛋白病的純合子出生，產(chǎn)前診斷非常重要，這些疾病的主要靶細(xì)胞是紅細(xì)胞，而孕婦血循環(huán)中存在著胎兒有核紅細(xì)胞，只是數(shù)量非常少，利用流式細(xì)胞儀可從孕婦血液中分選出胎兒有核紅細(xì)胞（分選條件：CD45-GPA+）進(jìn)行基因分析，作出產(chǎn)前診斷。
利用流式細(xì)胞儀分選免疫擔(dān)當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)研究也是目前的熱門課題。總之，流式細(xì)胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細(xì)胞，只要你想得到的某一亞群細(xì)胞有合適的單克隆抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀的分選功能將得到越來越多的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用。
其他
流式細(xì)胞儀可能在兩方面對骨髓增生異常綜合癥（MDS）有用，一是測定CD34陽性細(xì)胞數(shù)，以監(jiān)測病情，二是測定核蛋白增殖因子（PCNA）,有報(bào)告PCNA再在生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥、白血病三種疾病中表達(dá)有明顯差異，可輔助鑒別診斷。
此外流式細(xì)胞儀也可檢耐藥蛋白,如肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）、多藥耐藥蛋白（MRP）、 P170等。
流式細(xì)胞儀也可檢測細(xì)胞因子，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子如白介素系列（IL-1—IL-14）,腫瘤壞死因子(TNF),干擾素(IFN)等,只要用適當(dāng)?shù)拇蚩讋┘纯捎每股鲜黾?xì)胞因子單克隆抗體標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀測定。
