哈美頓MICROLAB-STAR移液工作站上的自動化蛋白結晶應用

伴隨著蛋白質組學領域產業(yè)界與學術界的重大發(fā)展，人們的注意力已經轉向對蛋白質及其三維結構與功能的研究。其中就包括采用蛋白質結晶法來確定蛋白結構。蛋白質結晶是一個多因素起作用的過程，取決于很多獨立參數(shù)的相互作用。這些參數(shù)包括：pH值、溫度、蛋白濃度、結晶劑濃度、雜質或添加劑的存在與否及其性質等。針對平行的結晶條件優(yōu)化試驗，哈美頓開發(fā)了MICROLAB?STAR蛋白結晶工作站。該工作站既可進行初級篩選也可進行次級篩選，既可采用懸滴法也可采用沉滴法，既可使用定制試劑也可使用商用試劑盒，既可使
用96孔也可使用384孔結晶板。

儀器與材料
MICROLAB-STAR蛋白結晶工作站（P/N 187007）
MICROLAB-STAR 8通道移液系統(tǒng)，樣品自動加載
MICROLAB-SWAP微孔板操作機械手
專用試劑載架
結晶專用實驗器材載架
防揮發(fā)蓋子
微孔板儲室切（存儲單元）
Linbro板載架（可選，用于懸滴法）

試劑盒篩選包（P/N 187008）
Falcon管載架
深孔板載架
擴展條碼讀碼器（可選）
用于標準鋼針的洗站（可選）

細化篩選包（P/N 187009）
專用試劑載架
擴展條碼讀碼器
用于標準鋼針的洗站
用于大體積鋼針的洗站（可選）
（篩選包不包括工作表）

操作流程
蛋白結晶包括兩個主要步驟：一是將結晶溶劑轉移到結晶板的主孔內，二是將結晶溶劑中的蛋白溶液懸于結晶板上鄰近的小孔中。MICROLAB?STAR蛋白結晶工作站（圖1）

可以利用儲存的溶液以及可用的篩選試劑盒中的溶劑來配制定制的結晶溶劑。

MICROLAB-STAR蛋白結晶工作站另外還可以選配試劑盒篩選包，用于試劑盒的篩選。也可以選配細化篩選包，用于細化篩選。在開始結晶方法之前，MICROLAB-SWAP會檢查微孔板儲室里是否有足夠的微孔板以使程序在無人干預條件下能夠運行，如有必要還會讀取微孔板的條碼。每塊板會與防揮發(fā)蓋子一起放到承載微孔板與蓋子的結晶架上。打開結晶板與試劑板的蓋子，向結晶板內加入最多150μl結晶溶劑。結晶板孔加完溶劑后，再吸取不同體積的蛋白溶液（通常為0.5-1.0μl）和等體積結晶溶劑，加到結晶板的小孔中．該步驟不需要混合過程，排除了蛋白與溶劑在小孔內不能充分混合的可能性。在加蛋白時對結晶板逐列處理。每加完一列MICROLAB-SWAP就馬上把防揮發(fā)蓋子蓋上.

試劑盒篩選
使用篩選試劑盒時，結晶溶劑必須先從溶劑試管分裝到96深孔板中并立即用防揮發(fā)蓋子蓋上，以保證配制好的溶液濃度不發(fā)生任何改變。完成這一步之后的移液與移板操作都與前面描述的相同。試劑盒篩選包適用于商用試劑盒。

細化篩選
細化篩選所需的結晶溶劑的配制要由工作表來決定。工作表中定義了儲存試劑的混合方法。MICROLAB-Vector軟件會在運行前搜索不完整的工作表或丟失的微孔板并排除這些錯誤。工作站也會檢查是否有足夠的試劑來完成工作表。這些檢查可以保證可靠的可離人的自動化細化篩選設置過程。完成這一步之后的移液與移板操作都與前面描述的相同。細化篩選需要用到細化篩選包。MICROLAB-STAR既能使用一次性吸頭也能使用可重復使用的不銹鋼針來移取結晶溶劑及其他試劑。移取蛋白的步驟要用一次性吸頭完成。由于擁有CO-RE專利技術，STAR吸頭的定位精度在各軸向上都可達到0.1毫米，遠遠超出了要將液體加到沉滴法微孔板的小孔（間距與1536孔板相同）中所需要的精度。

結果

驗證
在蛋白結晶工作站上利用測試蛋白和商用試劑盒在與手工操作相同的條件下進行了驗證。在初級篩選條件下（圖3a）4天后出現(xiàn)了晶體生長。在優(yōu)化條件下進行細化篩選，得到了數(shù)量更少但尺寸更大的晶體（圖3b）。
通過稱重法測定，0.5μl+0.5μl蛋白/溶劑移液步驟的準確度為7%。用稱重法測量，室溫下經過18小時后帶蓋的深孔板內液體損失小于0.4%，而無蓋深孔板內液體損失則達到8.5%。

通量
如果不需要混合過程，蛋白結晶工作站能在20分鐘內處理一塊96孔Greiner Crystal Quick板。在細化篩選實驗中，根據(jù)結晶溶劑混合物復雜度不同，每處理一塊板需要60到90分鐘不等。采用試劑盒篩選包，蛋白結晶工作站能在2小時40分鐘內用深孔板完成16個商用篩選。采用細化篩選包，可以在24小時內處理16塊結經晶板。

討論
哈美頓開發(fā)了用于全自動蛋白結晶的蛋白結晶工作站，它具有最高的可靠性和定位與移液準確度。程序一旦完成對微孔板、試劑以及工作表的檢查，工作站的工作將不再需要用戶的干預。

特點與優(yōu)點
通過對多孔板逐列處理控制結晶條件
實驗設計靈活
多孔板與實驗器材的使用靈活
可以交替使用一次性吸頭和可重復使用的鋼針，節(jié)約成本
自動系統(tǒng)檢查保證最大程度的可靠性和可離人自動化