正常人肺微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

實驗材料：

1. 手術(shù)切除的正常肺組織

2. 胰蛋白酶/EDTA液：0.05%胰蛋白酶，0.5mmol/L EDTA

3. 6孔培養(yǎng)板：用多聚賴氨酸包被

4. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS（pH=7.4），添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

5. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

6. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1． 將肺組織至于無菌的培養(yǎng)皿中用含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至無明顯血細胞；

2． 剪取肺組織邊緣微血管豐富的組織，用含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗兩次；

3． 將剪取的肺邊緣組織剪成2-3mm3大小，加入含雙抗的1×PBS（pH=7.4）清洗；

4． 用進行過滅菌處理的玻璃滴管將剪碎的組織塊和清洗用的1×PBS（pH=7.4）一起轉(zhuǎn)入15ml離心管中；

5． 250rpm/min離心2 min，小心傾去液體，再加入適量的含雙抗的1×PBS（pH=7.4），用玻璃滴管吹吸液體以清洗組織塊；

6． 繼續(xù)250rpm/min離心2 min，小心傾去液體，重復(fù)上述步驟若干次，直至離心后的液體中觀察不到明顯的紅色；

7． 將清洗好的組織塊重新轉(zhuǎn)至無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌的200 ml的吸頭將組織塊貼于25cm2培養(yǎng)瓶中；

8． 加入2ml培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置放于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中2-3h之后正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)；

9． 培養(yǎng)若干天后，可觀察到組織塊周圍陸續(xù)有細胞爬出，繼續(xù)培養(yǎng)幾天，直至組織塊周圍的細胞達到較高密度（培養(yǎng)其間兩天換液一次，換液操作時動作一定要輕柔，以防組織塊被搖下）；

10. 當(dāng)組織塊附近的細胞生長到較高密度后，將貼壁的組織塊吹下，換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24；

11. 24h后，用0.25%的Trypsin-EDTA消化細胞，FBS中止消化，將消化后的細胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管，1000rpm/min離心5min，之后傾去廢液，用培養(yǎng)基重懸細胞，轉(zhuǎn)入原來的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。