原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

 

微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的應(yīng)用和免疫磁珠技術(shù)的發(fā)展，使微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和純化變得相對(duì)簡(jiǎn)化。

 

人體主要器官和組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)培養(yǎng)成功的有：骨骼肌、心、腦、胃、視網(wǎng)膜、肺、皮膚、脈絡(luò)膜、小腸、脂肪、肝竇、腎、關(guān)節(jié)滑膜、胎盤(pán)、骨髓、胰島、角膜及食道等器官組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

 

目前分離內(nèi)皮細(xì)胞的方法主要有三種，即酶消化法、機(jī)械分離法和磁珠分離法。

 

酶消化法：優(yōu)點(diǎn)是分離的細(xì)胞多、純度較高；缺點(diǎn)是酶對(duì)某些蛋白有破壞作用。消化后的組織懸液需要用血清終止酶活性，并將組織懸液通過(guò)200目的金屬篩去除未消化組織。

機(jī)械分離法和磁珠分離法：可以避免酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，缺點(diǎn)是其他細(xì)胞的污染可能性較大。

磁珠分離法：利用特異的介質(zhì)(表面有內(nèi)皮細(xì)胞特異單克隆抗體的磁珠)從其他細(xì)胞群中分離出內(nèi)皮細(xì)胞。這種方法雖然可以分離出可用于炎癥研究的微血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是分離的細(xì)胞量少。

機(jī)械分離法：用于大血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離，這種方法避免了酶對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和其他細(xì)胞的污染。

 

（1）純化的方法：主要有利用尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾細(xì)胞懸液、物理刮除法、生長(zhǎng)特性選擇法、局部消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等。

（2）生長(zhǎng)特性選擇法：根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性加以分離，即已貼壁的組織塊，培養(yǎng)一段時(shí)間后除血細(xì)胞外，其他細(xì)胞尚未離開(kāi)組織塊而微血管內(nèi)皮細(xì)胞最先游出，這時(shí)立即移去組織塊，所留的大部分是血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，血細(xì)胞經(jīng)傳代1代至2代后自動(dòng)消除，剩下便是微血管內(nèi)皮細(xì)胞。這種方法由于避免了對(duì)細(xì)胞的機(jī)械和化學(xué)損傷，且不需特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，較為可取。

（3）局部消化法：當(dāng)不同類(lèi)型的細(xì)胞群之間界限明顯時(shí)，可在目的細(xì)胞區(qū)域滴加少量的消化酶，作用一段時(shí)間后，將消化液連同細(xì)胞吸出，再離心除去消化酶或終止消化后，將細(xì)胞接種于另外的培養(yǎng)板孔中進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法同物理刮除法一樣，要求目的細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量要大，并且與其他細(xì)胞界限相對(duì)明顯。

差速黏附法：內(nèi)皮細(xì)胞較成纖維細(xì)胞貼壁牢固，用胰酶消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下監(jiān)視，當(dāng)成纖維細(xì)胞收縮變圓脫壁時(shí)，立即用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，隨后輕輕吸去細(xì)胞液，大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞仍然保留在原培養(yǎng)板孔中。經(jīng)過(guò)數(shù)次同樣的處理，成纖維細(xì)胞基本可以被除去。

 

到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不同器官組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有共同的特異蛋白或標(biāo)志。

 

微血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：

（1）根據(jù)器官和組織的起源，從形態(tài)、表型、生化和功能等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（2）微血管內(nèi)皮細(xì)胞一般呈單層生長(zhǎng)，有接觸抑制現(xiàn)象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。

（3）表面表達(dá)CD31、CD34、凝血調(diào)節(jié)蛋白、第Ⅷ因子和選擇素等，細(xì)胞可攝取低密度脂蛋白，產(chǎn)生前列腺素，內(nèi)吞功能，結(jié)合植物血凝素，形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)絡(luò)。

 

根據(jù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，需要采用一些特殊的培養(yǎng)條件，并且這些培養(yǎng)條件可能因?yàn)槲⒀�管�?nèi)皮細(xì)胞的起源不同而有所差異。微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)一般選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰氨、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。