甲基化檢測(cè)——MS-HRM技術(shù)

HRM技術(shù)服務(wù)之甲基化檢測(cè)（MS-HRM技術(shù)）

    DNA甲基化是發(fā)生在DNA堿基序列上的一種共價(jià)修飾。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在5'-CpG-3'雙核苷酸序列的胞嘧啶上。在人類基因組中，大約有60%～70%的CpG胞嘧啶是甲基化的，其程度因不同的物種和細(xì)胞類型而異。DNA甲基化狀態(tài)在基因組中呈現(xiàn)出一定的分布模式，90％的甲基胞嘧啶位于重復(fù)序列上。DNA甲基化可以遺傳，并改變了DNA的結(jié)構(gòu)特性與基因活動(dòng)方式。

DNA甲基化意義：

    靶序列上甲基基團(tuán)的存在可以影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，引起轉(zhuǎn)錄抑制，從而使該基因表達(dá)受到抑制。啟動(dòng)子區(qū)CPG島的甲基化常�？梢砸种圃摶�因的轉(zhuǎn)錄，尤其是對(duì)于抑癌基因，凋亡相關(guān)基因，DNA修復(fù)基因等，啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化會(huì)影響功能的發(fā)揮。不同的腫瘤組織基因甲基化狀態(tài)不一樣，可以作為早期檢測(cè)，監(jiān)測(cè)腫瘤形成的重要標(biāo)志物。對(duì)于某些特異基因的甲基化，更加重要，如DNA修復(fù)基因，可以引起對(duì)化療藥物的敏感，從而作為藥物治療療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，指導(dǎo)臨床用藥。

檢測(cè)方法：

作為新一代的遺傳掃描工具，HRM具有“簡(jiǎn)、效、快、廉”等其它技術(shù)難以比擬的優(yōu)勢(shì)：

簡(jiǎn)：無(wú)需序列特異性探針，不受堿基位點(diǎn)局限，同時(shí)檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點(diǎn)；閉管操作，避免交叉污染。

效：最低檢測(cè)0.1%-0.01%的突變或異常甲基化，檢測(cè)SNP靈敏度和特異性均為100%。

快：1次同時(shí)檢測(cè)不多于384個(gè)樣本，在60-90分鐘內(nèi)完成檢測(cè)。

廉：簡(jiǎn)化操作步驟、降低人工和試劑成本，費(fèi)用遠(yuǎn)少于測(cè)序、Taqman探針等方法。

    HRM技術(shù)特別適用于樣本量多、檢測(cè)位點(diǎn)較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測(cè)方法（檢測(cè)位點(diǎn)多，樣本少）的高通量方法。同時(shí)，也是基因芯片篩選后的多個(gè)基因在更多標(biāo)本中驗(yàn)證的最佳方法。

DNA甲基化-HRM檢測(cè)原理：

    甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（MS-High Resolution Melting Curve Analyse）是一種不需要 PCR 產(chǎn)物后續(xù)操作的，簡(jiǎn)單且靈敏的檢測(cè)基因甲基化水平的方法。該方法主要通過(guò)比較曲線的熔解溫度和峰形得以實(shí)現(xiàn)并且可以在一些列的 CpG 位點(diǎn)中檢測(cè)出單一的一個(gè)甲基化的發(fā)生，同時(shí)，也可以對(duì)一系列的 CpG 位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行分析。單個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化和平均的甲基化水平會(huì)對(duì)熔解曲線的形狀造成影響。采用重亞硫酸鹽處理 DNA 模板可以使 5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在PCR反應(yīng)前，在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后DNA 鏈的引物，這對(duì)引物中間包含有意義的甲基化CpG島，一旦這些CpG島發(fā)生甲基化，使胞嘧啶（C）不發(fā)生變化，而與未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶（T），樣品中的 GC 含量發(fā)生了變化，最終被轉(zhuǎn)化成了熔解曲線 Tm 值之間的差異。 CpG 位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對(duì)位置也會(huì)對(duì)熔解峰的形狀產(chǎn)生影響，因此， 根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測(cè)出樣本的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度。

    HRM方法操作簡(jiǎn)單、靈敏高、重復(fù)性高、成本低、不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限高度等等優(yōu)勢(shì)，將對(duì)于遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)等方面的研究和臨床應(yīng)用提供更大的幫助。