SNP檢測——HRM技術應用
HRM技術服務之SNP檢測（snp檢測的最佳方案）
單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指單個核苷酸堿基的改變，包括置換、顛換、缺失和插入，導致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，這就是SNP。SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學標記。
HRM檢測SNP技術是依據(jù)在一定的溫度范圍內(nèi)將PCR擴增的產(chǎn)物進行變性，期間實時檢測體系內(nèi)熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩(wěn)定性和重復性。根據(jù)曲線準確區(qū)分野生型純合子、雜合子和突變性純合子（下圖）。
檢測SNP的方法有很多種。成本較低、通量較大的方法大都局限于已知、特定位點，如Taqman探針法。既要對已知位點分析又要查找未知位點，一般采用PCR+測序的方法，成本高、操作繁復較低。
作為新一代的遺傳掃描工具,HRM技術是一種低成本、高通量、快速，且不受位點局限的檢測方法，是SNP篩查的最佳選擇。其具有"簡、效、快、廉"等其他技術難以比擬的優(yōu)勢:
簡：無需序列特異性探針,不受堿基位點局限,同時檢出已知或未知突變、SNP和甲基化位點：閉管操作，避免交叉污染。
效：最低檢測0.1%-0，01%的突變或異常甲基化檢測SNP靈敏度和特異性均為100%，。
快：1次同時不多于384個樣本，在60-90分鐘內(nèi)完成檢測。
廉：簡化操作步驟、降低人工和試劑成本，費用遠少于測序、Taqman探針等方法。
HRM技術特別適用于樣本量多、檢測位點較少的SNP、突變或甲基化分析，是不同于基因芯片檢測方法（檢測位點多，樣本少）的高通量方法。同時，也是基因芯片篩選后的多個基因在更多標本中驗證的最佳方法。
附表之SNP相關研究方法：
| 研究方法 |
優(yōu)點 |
缺點 |
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直接測序法 |
SNP分析的金標準，能發(fā)現(xiàn)已知和未知SNP位點 |
每個位點均需要經(jīng)PCR擴增，然后測序，成本較高，工作量大，周期特別長，價格昂貴，不適合大樣本做疾病關聯(lián)分析，且容易交叉污染。 |
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Taqman探針法（定量PCR） |
適合已知SNP位點、位點數(shù)量少、通量高的檢測 |
價格昂貴（探針合成費用高），不能同時發(fā)現(xiàn)未知SNP位點 |
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非探針的普通PCR方法 |
技術簡便，價格便宜，僅適用已知SNP判斷，不能確定何種SNP，適宜少量樣本的實驗室檢測 |
費時費力，速度較慢，靈敏度差；RFLP僅能檢測有酶切位點的 SNP，無酶切位點不能檢測；上述方法都需要凝膠電泳，DNA鏈二級結構容易造成人工假相，使結果出現(xiàn)偏差。SSCP、DGGE花費時間長、穩(wěn)定性差、靈敏度有限，難以大規(guī)模開展工作。 |
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芯片技術 |
與傳統(tǒng)的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化、防污染等特點 |
僅適用于全基因組SNP掃描，不適宜單個基因的SNP位點檢測，精度低，價格昂貴。 |
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Illumina 技術 |
這種方案可以幫助研究人員在得益于起始樣品量要求很低優(yōu)點的同時，還能夠檢測多個感興趣的區(qū)域，從而檢出罕見的基因突變。 |
高通量SNP檢測，用于SNP在全基因組上的掃描分析，價格昂貴。 |
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MALDI-TOF MS質(zhì)譜技術 |
檢測速度快，理論上能分開單個堿基變化 |
這種純物理檢測易受到樣本因素的多種干擾，精確度難以保證。這種方法適宜于已經(jīng)優(yōu)化的特定SNP檢測，不適宜該服務商未做過或很少做過的新SNP檢測。檢測過程需要多點質(zhì)控，否則精確度很低。另外，很重要的一點是這個檢測PCR過程和質(zhì)譜過程是分開的，PCR需要自己做，并不便宜。 |
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基于羅氏LightCyclerTM 480的HRM技術 |
高通量、簡單、快速、省錢、高靈敏度；閉管檢測，避免污染造成的假陽性；擴增區(qū)內(nèi)已知和未知SNP都能檢測；靈敏度和精確度達到近100%；HRM分析和PCR是在同時進行，無需另外儀器，相比MS等減少了額外儀器，無疑成本更低，非特異性和精確度更好。 |
須用羅氏LightCyclerTM 480 PCR儀，或LightScannerTM等儀器 |
