正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)
正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 軟骨細(xì)胞來(lái)源：20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨和脛骨；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml膠原酶混合消化液，用PBS液配制；
4. 消化液Ⅱ：0.5mg/ml膠原酶，用培養(yǎng)液Ⅰ配制；
5. 培養(yǎng)液Ⅰ：DMEM培養(yǎng)液，補(bǔ)充10%胎牛血清；
6. 培養(yǎng)液Ⅱ：DMEM培養(yǎng)液中補(bǔ)加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、鏈霉素1mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%維生素添加劑（vitamin supplements）以及維生素C 50μg/ml；
7. 10% poly HEMA：稱取6g多聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyethylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒溫振蕩水浴箱中緩慢振蕩過(guò)夜，次日將所得溶液離心（2500r/min，10min），除去未溶解的顆粒，此為干液。取1ml干液與9ml 95%乙醇混合，稀釋成10%（V/V）的poly HEMA溶液；
8. 篩網(wǎng)：孔徑為100μm的尼龍篩網(wǎng)；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 在無(wú)菌條件下，從20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨頭和脛骨坪切取骺軟骨。用PBS液洗凈血液。盡量除去纖維性組織；
2. 將軟骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；
3. 棄孵育液。將軟骨塊充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育過(guò)夜；
4. 用尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液中加入培養(yǎng)液Ⅰ。再經(jīng)250g離心5min，棄上清液；
5. 用培養(yǎng)液Ⅰ將細(xì)胞團(tuán)吹散，重新懸浮細(xì)胞，離心。重復(fù)4次。用培養(yǎng)液將最后得到的細(xì)胞團(tuán)制成懸液；
6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。從每克軟骨平均可獲得大約3.0×108個(gè)軟骨細(xì)胞；
7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液鋪在直徑為60mm的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，水平放置在通風(fēng)的超凈工作臺(tái)上干燥（過(guò)夜）；
8. 使用前將包被poly HEMA的培養(yǎng)皿用滅菌紫外燈照射30min；
9. 將含5×106個(gè)軟骨細(xì)胞的懸液接種到已包被poly HEMA的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
10.每3—4d換一次液。培養(yǎng)可持續(xù)半年以上；
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 軟骨細(xì)胞來(lái)源：20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨和脛骨；
2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；
3. 消化液Ⅰ：2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml膠原酶混合消化液，用PBS液配制；
4. 消化液Ⅱ：0.5mg/ml膠原酶，用培養(yǎng)液Ⅰ配制；
5. 培養(yǎng)液Ⅰ：DMEM培養(yǎng)液，補(bǔ)充10%胎牛血清；
6. 培養(yǎng)液Ⅱ：DMEM培養(yǎng)液中補(bǔ)加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、鏈霉素1mg/ml、兩性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%維生素添加劑（vitamin supplements）以及維生素C 50μg/ml；
7. 10% poly HEMA：稱取6g多聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯（2-hydroxyethylmethacrylate，poly HEMA），加到50ml 95%乙醇中，于37℃恒溫振蕩水浴箱中緩慢振蕩過(guò)夜，次日將所得溶液離心（2500r/min，10min），除去未溶解的顆粒，此為干液。取1ml干液與9ml 95%乙醇混合，稀釋成10%（V/V）的poly HEMA溶液；
8. 篩網(wǎng)：孔徑為100μm的尼龍篩網(wǎng)；
實(shí)驗(yàn)方法：
1. 在無(wú)菌條件下，從20—24周自然流產(chǎn)胎兒的股骨頭和脛骨坪切取骺軟骨。用PBS液洗凈血液。盡量除去纖維性組織；
2. 將軟骨放入消化液Ⅰ中，于37℃孵育1h；
3. 棄孵育液。將軟骨塊充分切碎，加入消化液Ⅱ，在37℃孵育過(guò)夜；
4. 用尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液中加入培養(yǎng)液Ⅰ。再經(jīng)250g離心5min，棄上清液；
5. 用培養(yǎng)液Ⅰ將細(xì)胞團(tuán)吹散，重新懸浮細(xì)胞，離心。重復(fù)4次。用培養(yǎng)液將最后得到的細(xì)胞團(tuán)制成懸液；
6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。從每克軟骨平均可獲得大約3.0×108個(gè)軟骨細(xì)胞；
7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液鋪在直徑為60mm的塑料培養(yǎng)皿內(nèi)，水平放置在通風(fēng)的超凈工作臺(tái)上干燥（過(guò)夜）；
8. 使用前將包被poly HEMA的培養(yǎng)皿用滅菌紫外燈照射30min；
9. 將含5×106個(gè)軟骨細(xì)胞的懸液接種到已包被poly HEMA的培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
10.每3—4d換一次液。培養(yǎng)可持續(xù)半年以上；
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