原代懸浮細胞吉姆薩染色法

原代懸浮細胞吉姆薩染色法

涂片法：

1. 用含有5%—10%血清的等滲液將培養(yǎng)的細胞調(diào)制成密度為106個/ml的細胞懸液；
2. 將1滴細胞懸液滴于一張載玻片的一端，用另一塊干凈的載玻片，按照血液涂片法將細胞鋪展于載玻片上；
3. 載玻片在空氣中干燥后，再用甲醇固定；
4. 對涂有細胞的載玻片進行染色；
5. 注意，為避免細胞皺縮應(yīng)盡快使涂有細胞的載玻片干燥，可搖動載玻片或用吹風機的冷風迅速吹干；
6. 用甲醇固定，吉姆薩染色；

離心法：

1. 需使用離心涂片機將細胞懸液的細胞直接離心沉淀在載玻片上，使細胞的離心沉淀和涂片同時進行；
2. 制備細胞懸液，細胞懸液中用含有少量蛋白質(zhì)，并將細胞濃度調(diào)至106個/ml；
3. 將濾紙片孔對準出孔，然后插入機頭凹槽內(nèi)，用彈簧片頂緊，使濾紙片夾于標本室的出孔與載玻片之間；
4. 離心標本必須對稱放置，保持平衡。然后吸取細胞懸液0.1—0.2ml迅速滴入標本室入口，以1000r/min離心5min；
5. 離心完畢后自動關(guān)機。取出載玻片在空氣中干燥后；
6. 用甲醇固定，吉姆薩染色；

真空過濾法：

1. 用含有10%血清的培養(yǎng)液將培養(yǎng)物調(diào)制成濃度為106個/ml的細胞懸液；
2. 取5—10ml細胞懸液，用直徑為25mm、孔徑為0.5μm的Nucleopore多孔；
3. 當過濾懸液還剩余2ml左右時，輕輕加入110ml平衡鹽溶液繼續(xù)過濾，到
剩余2ml時，再加入10ml平衡鹽溶液，繼續(xù)過濾。如此再重復一次。此步驟中平衡鹽溶液有漂洗細胞的作用，既能保證細胞充分、均勻地過濾，又為隨后的甲醇固定作好準；
4. 然后加10ml甲醇到平衡鹽溶液中，一直重復到過濾出的液體是純甲醇為止；
5. 空氣中干燥，待甲醇完全揮發(fā)后，進行吉姆薩染色；

染液制備：

1. 稱取0.5g吉姆薩粉和22ml甘油；
2. 取少量甘油與吉姆薩粉在研缽內(nèi)充分混合，研磨至無顆粒；
3. 將剩余的甘油倒入研缽，于56℃保溫2h；
4. 加入33ml純甲醇混勻，即為吉姆薩母液，將其保存于棕色試劑瓶內(nèi)；
5. 取9份pH6.80—7.38的Sorensen緩沖液和1份吉姆薩母液混合即得染色液；
7. 按2ml/cm2的比例滴加吉姆薩染液，覆蓋細胞層，染色2min；
8. 移除染液，用自來水沖洗掉粉紅色背景后，再用去離子水沖洗細胞；
9. 用顯微鏡觀察單層潮濕細胞。若細胞已干，可重新使細胞潮濕后再觀察；

結(jié)果：

細胞核被染成紫紅色或紫藍色，而細胞質(zhì)則被染成淺紅色；

注意事項：

1. 染液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，舊染液染色效果不佳。染液保存時間不宜超過48h；
2. 吉姆薩對pH極敏感，因此，緩沖液pH要準確，否則染色效果不佳。如用染色缸染色時，隨染色時間的延長，在染液表面常形成一層氧化膜（發(fā)亮）易附著在玻片上形成污穢，且不易除掉。因此在用染色缸染色，尤其用的不是現(xiàn)配者時，染色前應(yīng)先用小片濾紙刮除液面的氧化層再進行染色。染色完畢，應(yīng)把標本浸入水中漂洗染液；