應(yīng)用非標(biāo)記探針法進(jìn)行基因分型

      RET原癌基因單個(gè)堿基的突變可以引發(fā)多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型。RET突變傳統(tǒng)的基因分型方法是外顯子測(cè)序。一種閉管操作的基因分型方法已經(jīng)成熟，此方法用的是一種飽和DNA染料，非標(biāo)記探針及高分辨率熔解擴(kuò)增子分析。此方法需要兩個(gè)連續(xù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)階段，主要的和第二次實(shí)驗(yàn)。主要的實(shí)驗(yàn)共用7個(gè)反應(yīng)和8個(gè)非標(biāo)記探針分析RET基因外顯子10、11、13、14和16 。主要實(shí)驗(yàn)基因分型了野生型外顯子，外顯子13普通的多態(tài)性，外顯子16的一個(gè)突變及其它檢測(cè)到的序列變化。主要非標(biāo)記探針數(shù)據(jù)限制檢測(cè)到的RET基因序列突變的基因分型，這些突變位點(diǎn)的基因分型在第二次實(shí)驗(yàn)的2-5個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行。設(shè)計(jì)6條探針，所用方法是：用遮蔽技術(shù)和遮蔽選擇的序列變化使探針下其它位置的突變的分析變得明確。這兩步RET基因分型之后，少于實(shí)驗(yàn)0.2%的外顯子需要測(cè)序確定基因型。對(duì)5個(gè)野生型和29個(gè)可用的RET序列突變樣品（與測(cè)序結(jié)果100%一致）做盲研究。用非標(biāo)記探針和遮蔽技術(shù)進(jìn)行高分辨率熔解分析是快速、精確的基因分型方法，>50的RET序列突變可以進(jìn)行基因分型。

      多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤2型（MEN2）綜合癥，MEN2A，MEN2B及家族性甲狀腺髓樣癌由生殖細(xì)胞系RET基因外顯子10、11、13和16的突變引發(fā)。MEN2綜合癥是常染色體顯性秩序失調(diào)引起的高生命危險(xiǎn)的甲狀腺癌。RET突變的遺傳學(xué)檢測(cè)可以確認(rèn)處于甲狀腺癌危險(xiǎn)中但是沒有爆發(fā)癌癥的病人，此時(shí)切除甲狀腺可以增加存活的機(jī)率。
      之前有許多實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)或基因分型RET突變，比如說(shuō)單鏈構(gòu)象多態(tài)性，變性梯度凝膠電泳，溫度梯度毛細(xì)管電泳，限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，焦磷酸測(cè)序，熒光標(biāo)記雜交探針及微衛(wèi)星。但是，這些方法中的大多數(shù)需要PCR反應(yīng)之后的操作來(lái)檢測(cè)突變。其中一些方法報(bào)道突變檢測(cè)的敏感性為95%或少于95%，或者僅實(shí)驗(yàn)了RET突變樣品的一小部分。這些方法分析RET序列變化的限制范圍，可能只以普通突變?yōu)槟繕?biāo)而錯(cuò)過了稀有突變。此外，不致病多態(tài)性的存在可以導(dǎo)致異常的結(jié)果。因?yàn)檫@些限制，RET外顯子測(cè)序保持黃金標(biāo)準(zhǔn)。
      測(cè)序是一種耗時(shí)且昂貴的開管實(shí)驗(yàn)，需要生成PCR產(chǎn)物之后的額外操作。相反，高分辨率熔解曲線的突變掃描分析是一種快速且便宜的閉管操作實(shí)驗(yàn)，不需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物之后的額外操作。通過用一種飽和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲線分析可以檢測(cè)PCR擴(kuò)增子之內(nèi)的序列變化。對(duì)檢測(cè)PCR擴(kuò)增子內(nèi)雜合點(diǎn)突變的高分辨率熔解技術(shù)的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)400bp之內(nèi)的擴(kuò)增子的敏感性和特異性是100%。最近，我們證實(shí)用高分辨率熔解分析進(jìn)行RET外顯子突變掃描。雖然這種方法在盲實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)100%的突變，但是有些罕見的突變的熔解曲線相似，完全進(jìn)行基因分型是困難的，在這種情況下，在最初的突變掃描之后需要測(cè)序。另一種方法，添加雜交探針可以分出RET突變的絕大多數(shù)的基因型，而不需要測(cè)序。
      熒光標(biāo)記雜交探針分析是一種快速、閉管操作的實(shí)驗(yàn)，可以通過探針/等位基因的熔解溫度基因分型序列變化，但是需要昂貴的寡核苷酸修飾。非標(biāo)記探針也可以通過Tm的不同進(jìn)行基因分型，也是一種閉管操作的實(shí)驗(yàn)，需要LC Green染料。因?yàn)橛肈NA飽和染料檢測(cè)，非標(biāo)記探針和擴(kuò)增數(shù)據(jù)可以從一個(gè)熔解曲線分析。Zhou等最近證實(shí)非標(biāo)記探針基因分型分析可以補(bǔ)充突變掃描。但是，在同一個(gè)外顯子之內(nèi)的RET所有突變不能只用一條探針進(jìn)行基因分型，因?yàn)樘结樝绿囟ㄍ蛔兊娜劢鉁囟认嗨苹蛳嗤��?BR>      為了完成閉管基因分型實(shí)驗(yàn)，發(fā)明了兩步RET基因分型方法，此方法比測(cè)序技術(shù)成本低，耗時(shí)少。用于擴(kuò)增熔解的第一個(gè)PCR階段（主要實(shí)驗(yàn)），掃描RET外顯子的序列變化，反之，非標(biāo)記探針分析位于突變范圍內(nèi)，且分辨可能的基因型。第二個(gè)PCR階段（第二次實(shí)驗(yàn)）需要限定數(shù)目的特定突變的探針對(duì)>50的RET序列突變進(jìn)行明確的基因分型。用遮蔽技術(shù)設(shè)計(jì)的探針簡(jiǎn)化了突變分離。當(dāng)探針下有多重的可能的序列突變使分析變得復(fù)雜時(shí)，遮蔽技術(shù)簡(jiǎn)化了探針熔解的判斷。在多態(tài)位點(diǎn)選擇含有錯(cuò)配的（缺失、不匹配堿基或一般堿基）可以遮蔽的序列變化。這樣的話就在遮蔽多態(tài)位點(diǎn)人為的創(chuàng)造了一個(gè)與可能的等位基因的錯(cuò)配。野生型與遮蔽突變的等位基因都有一個(gè)與探針錯(cuò)配的堿基和相似的Tm。然而，突變等位基因在探針下其它的位置有一個(gè)額外的錯(cuò)配，可以通過比僅在遮蔽位置變化的等位基因稍低的Tm值鑒定。

材料和方法

樣品
      此報(bào)道中用到的野生型RET基因的DNA基因組樣品或有RET序列變化的樣品在以前描述過。RET基因序列變化改變RET蛋白的功能引發(fā)MEN2綜合癥的是突變，然而RET序列改變不會(huì)引發(fā)MEN2綜合癥是多態(tài)。不能確定意義的稀有的或不會(huì)引起MEN2綜合癥的RET基因序列變化成為“序列變化”。在這份報(bào)告中，通過密碼子數(shù)列出RET序列變化，野生型編碼DNA序列后面是編碼序列改變，伴隨著加粗突變核苷酸（例：618（TGC→TAC）），反之多態(tài)及序列變化用下劃線標(biāo)出。所有測(cè)試的RET序列變化的樣品均有單個(gè)核苷酸改變，并且是雜合的除非有另外的闡明。RET突變基因型和多態(tài)性及序列變化基因型列于表1。

*序列變化是雜合的除非在文本上另作說(shuō)明。密碼子DNA序列列出核苷酸改變，加粗突變且多態(tài)性或序列變化使加下劃線的。•，可用的RET序列變化樣品。
†未知意義的稀有序列變化或不引發(fā)MEN2綜合癥；查看參考文獻(xiàn)。在RET致病密碼子范圍內(nèi)密碼子609或611的3個(gè)突變體與MEN2綜合癥沒有聯(lián)系。密碼子922和852的突變體以前在MTC病人上發(fā)現(xiàn)過，也許不會(huì)引發(fā)MEN2綜合癥。
‡良性多態(tài)性，0.26等位基因頻率。
§806與804突變?cè)谕�一等位基因時(shí)致病。

引物和探針
      用完整DNA技術(shù)合成寡核苷酸。用Primer3設(shè)計(jì)引物。選擇引物和探針檢測(cè)所有已知RET突變，不包括分析中的普通多態(tài)（表2）。非標(biāo)記探針包含有3’磷酸化或3’氨基修飾（整合DNA技術(shù)），避免PCR反應(yīng)中的延伸。設(shè)計(jì)的探針用于分析每個(gè)外顯子的突變熱點(diǎn)。
      RET基因分型實(shí)驗(yàn)中用了4種非標(biāo)記探針（表2）：野生型（WT）探針，特定突變（MS）探針，只遮蔽單一多態(tài)核苷酸的遮蔽探針，遮蔽3個(gè)多態(tài)核苷酸的位置探針（一個(gè)密碼子）。比如說(shuō)，外顯子13遮蔽探針（遮蔽1bp 769）在多態(tài)核苷酸位置有單個(gè)堿基的缺失。（WT13探針的“T”位置，表2）。外顯子10和11位置探針與野生探針序列相比有3個(gè)核苷酸缺失，遮蔽一個(gè)致病密碼子分辨密碼子突變的位置。外顯子10和11在致病密碼子位置有同樣的序列改變。比如說(shuō)：外顯子10，MS618/620TAC探針在密碼子618-620有TAC序列， 如表2描述。

*最終引物的濃度和上下引的比例在引物序列上顯示。列出引物序列從5’到3’，上游引物在下游引物上部。
†每個(gè)探針集下是密碼子的變化。下劃線密碼子包括了多態(tài)或序列變化，反之其它密碼子包括突變。
‡遮蔽，遮蔽1-3個(gè)核苷酸的缺失。主要實(shí)驗(yàn)中的野生型探針序列用于每個(gè)外顯子，除了外顯子16。如果兩個(gè)野生型探針用于一個(gè)外顯子，標(biāo)記做A和B探針。
§探針序列從5’到3’顯示，RET外顯子10、13、14和16是上游探針，反之，外顯子11是下游探針。已知突變的位點(diǎn)加粗，可能的多態(tài)性或序列變化位點(diǎn)用下劃線表示。
¶位置（L）探針與野生型探針序列致病密碼子相比有3個(gè)核苷酸遮蔽缺失（---）。
‖用于外顯子10,11突變的基因分型的MS探針的例子。在探針內(nèi)致病密碼子位置的相同的特定突變序列。這些探針有特定突變序列的名稱，改變的序列加粗。有7個(gè)可能的從TGC 野生型半胱氨酸到其他氨基酸的突變序列改變。因此，21個(gè)MS探針中的7個(gè)特定突變探針（AGC，CGC，GGC，TAC，TCC，TTC，TGG）是用于外顯子10和11突變。用于每個(gè)突變基因分型的MS探針用圖解法表示，表3和補(bǔ)充表格1-5。
**外顯子13的主要和第二次試驗(yàn)用遮蔽探針。遮蔽 1bp 769 主要探針及外顯子特定突變探針在密碼子769多態(tài)位置有單核苷酸缺失（缺失野生型探針序列有下劃線的“T”）。
††外顯子16用918（ATG-ACG）密碼子特定突變探針做主要實(shí)驗(yàn)。

PCR
      用之前描述的不對(duì)稱快速PCR擴(kuò)增樣品DNA，除了用表2中給出的引物濃度反應(yīng)55個(gè)循環(huán)。外顯子14反應(yīng)包括2個(gè)探針，0.5μmol/L的WT14A探針和0.25μmol/L的WT14B探針。在主要實(shí)驗(yàn)和第二次實(shí)驗(yàn)一個(gè)野生型對(duì)照與每個(gè)探針一起參加反應(yīng)。外顯子13， WT13主要的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)用2個(gè)額外的對(duì)照：雜合和純合密碼子769樣品。外顯子10主要實(shí)驗(yàn)反應(yīng)用620（TGC→AGC）突變樣品作為正對(duì)照。

高分辨率熔解 
      在高分辨率熔解儀器HR-1（愛荷華科技，鹽湖城，猶他州）上進(jìn)行分析，將LightCycle毛細(xì)管加入HR-1中，0.3℃/s加熱。主要的實(shí)驗(yàn)中，RET外顯子的擴(kuò)增及非標(biāo)記探針熔解數(shù)據(jù)從60℃到95℃采集。主要實(shí)驗(yàn)分析了每個(gè)外顯子的擴(kuò)增子及探針數(shù)據(jù)，除了外顯子14。因?yàn)樗�有�?bào)道的外顯子14突變都包含在非標(biāo)記探針下，只分析了探針數(shù)據(jù)。第二次實(shí)驗(yàn)，只分析了在60℃-89℃采集的非標(biāo)記探針熔解的數(shù)據(jù)。

      高分辨率熔解數(shù)據(jù)用之前描述由LabView編寫的定制軟件分析。簡(jiǎn)言之，擴(kuò)增子的熔解曲線數(shù)據(jù)是規(guī)范化的，溫度轉(zhuǎn)移之后轉(zhuǎn)換成派生圖或熒光差異圖。依據(jù)用于擴(kuò)增分析的數(shù)據(jù)圖，由于從野生型對(duì)照的視覺偏移的不同曲線形狀較寬的派生熔解峰，獨(dú)特形狀的熔解峰（肩峰或兩個(gè)峰），熔解溫度的偏移，和/或熒光不同來(lái)檢測(cè)序列變化。擴(kuò)增熔解曲線，派生圖，熒光不同的圖都可以用來(lái)檢測(cè)RET序列變化。非標(biāo)記探針熔解數(shù)據(jù)直接轉(zhuǎn)換成派生圖。外顯子14探針數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，在分析之前指數(shù)背景已消除。
在派生熔解峰的1/2出估計(jì)非標(biāo)記探針數(shù)據(jù)的Tms。雜合樣品的△Tms定義為野生型等位基因Tm減去變化（突變，多態(tài)性，或序列變化等位基因）等位基因Tm的值。注意：當(dāng)變化等位基因的Tm值高于野生型的等位基因Tm（例如：和互補(bǔ)的特定突變探針），△Tms的值是否定的。雜合樣品的探針數(shù)據(jù)導(dǎo)致肩峰或平穩(wěn)形狀的峰，峰面積分為1/4，1/2和1/4野生型范圍，變化等位基因Tms在這些區(qū)域的邊界。因?yàn)榧兒献有蛄凶兓�（沒有野生型等位基因）或變化等位基因Tm值與野生型等位基因Tm值相同時(shí)（沒有可識(shí)別的野生型等位基因）當(dāng)只有單個(gè)峰是顯而易見的。之后，野生型對(duì)照樣品Tm在計(jì)算△Tms時(shí)用于計(jì)算野生型等位基因Tm。野生型樣品也會(huì)導(dǎo)致單一的峰，所以，從野生型對(duì)照Tm減去樣品的單個(gè)等位基因Tm值。
每個(gè)RET序列變化的主要探針△Tm值決定用于第二次基因分型實(shí)驗(yàn)的特定突變探針。如果RET突變無(wú)法利用（表1），用之前描述的臨近的參數(shù)估計(jì)預(yù)計(jì)△Tms值。以經(jīng)驗(yàn)為主的決定和預(yù)測(cè)RET序列變化的△Tm值與主要探針確定△Tm的范圍，期望特定探針選項(xiàng)分組突變。補(bǔ)充表1-5（參閱）顯示△Tm的范圍及主要探針分析的突變分組及每個(gè)可用的RET序列變化和主要探針及選擇的第二個(gè)探針的△Tm值。Tm標(biāo)線放置在派生的平面圖，通過從野生型對(duì)照等位基因的Tm減去主要實(shí)驗(yàn)的△Tm范圍計(jì)算Tm，如外顯子10和11主要探針?biāo)�示。這些Tm知道方針便于快速、視覺分組突變樣品，選擇第二次試驗(yàn)的特定突變的探針。但是，計(jì)算每個(gè)樣品的△Tm值可以更好的對(duì)照由特定樣品的不同引起的系統(tǒng)Tm值的偏移（改變鹽的濃度，不同的樣品提純方法或溫度不精確）。

盲研究
      29個(gè)RET突變樣品（表1中列出的可用的突變，多態(tài)性和序列變化）和5個(gè)野生型樣品用于生成盲研究。外顯子13，14各分析10個(gè)樣品，外顯子11分析20個(gè)樣品，外顯子10分析28個(gè)樣品（補(bǔ)充表格6， http://www.jmd.amjpathol.org）。每個(gè)外顯子，野生型樣品和變化的樣品數(shù)目是未知的。盲研究擴(kuò)增分析，用派生熔解曲線數(shù)據(jù)的獨(dú)特的派生峰形狀和從野生型對(duì)照的Tm移動(dòng)可以明顯的區(qū)分序列變化，雖然RET序列變化可以在三種平面圖中檢測(cè)：熔解曲線，派生熔解曲線，熒光信號(hào)不同。用WT10A，WT13探針的主要實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增子派生熔解數(shù)據(jù)分別用來(lái)掃描外顯子10和13的突變。
      從主要實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣品的探針數(shù)據(jù)計(jì)算△Tm值（如果需要，從第二次實(shí)驗(yàn)中計(jì)算）。△Tm數(shù)據(jù)表用來(lái)決定基因型或從第二次實(shí)驗(yàn)中選擇特定突變的探針（補(bǔ)充表1-5；）。表3（補(bǔ)充表1-5的簡(jiǎn)化版本，http://jmd.amjpathol.org）顯示了RET基因分型實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理圖，也可以用于選擇第二個(gè)探針。Tm標(biāo)線選擇外顯子10和11特異突變探針的能力與用計(jì)算每個(gè)樣品的Tm值來(lái)選擇探針相比較。主要實(shí)驗(yàn)之后，樣品標(biāo)記為野生型，外顯子13多態(tài)性， 外顯子16密碼子918突變，或其他RET序列變化。檢測(cè)序列變化的主要探針的△Tm值決定用于第二次基因分型實(shí)驗(yàn)的特定突變探針，在RET序列突變的地方進(jìn)行基因分析。

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
      RET外顯子10、11、13、14和16的基因分型通過兩個(gè)步驟完成，閉管實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括主要和次要的實(shí)驗(yàn)（表3）。因?yàn)橛昧薉NA雙鏈飽和染料，每個(gè)反應(yīng)生成非標(biāo)記探針和擴(kuò)增子熔解數(shù)據(jù)。主要實(shí)驗(yàn)包括7個(gè)PCR反應(yīng)和8條探針，用于掃描序列變化和分辨一些基因型（野生外顯子，外顯子13密碼子769多態(tài)性和外顯子16密碼子918突變）。在主要實(shí)驗(yàn)中只檢測(cè)了序列變化但沒有基因分型的外顯子在第二次實(shí)驗(yàn)中用選擇的探針進(jìn)行測(cè)試。只用擴(kuò)增數(shù)據(jù)檢測(cè)稀有序列變化的樣品（探針下的野生型序列）或在第二次試驗(yàn)中用特定突變探針沒有基因分型的稀有序列變化需要通過測(cè)序來(lái)確定基因型（實(shí)驗(yàn)的外顯子的~0.2%）。

*RET5個(gè)外顯子的主要實(shí)驗(yàn)中包括了7個(gè)PCR反應(yīng)和8條探針（外顯子14是多重的）。列出的主要探針與每個(gè)RET外顯子相對(duì)：WT，野生型；MS，特定突變。主要實(shí)驗(yàn)用外顯子13密碼子769（CTT→CTG）多態(tài)和外顯子16密碼子918（ATG→ACG）的突變的探針及擴(kuò)增子的熔解數(shù)據(jù)來(lái)區(qū)分野生型。從主要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（檢測(cè)外顯子的7%）中的△Tm值選擇第二個(gè)探針，檢測(cè)其它的序列變化。有兩個(gè)例外，樣品需要測(cè)序（很少）：1）外顯子16檢測(cè)的其它序列變化而不是密碼子918突變，或2）主要探針檢測(cè)的序列變化的△Tm值在選擇的第二個(gè)探針給定范圍之外。這樣的話主要探針會(huì)檢測(cè)到兩個(gè)以上的序列變化或檢測(cè)到異常序列的變化。
†列出的主要實(shí)驗(yàn)的Tm值用于決定樣品的基因型或檢測(cè)在擴(kuò)增子之內(nèi)但是不在探針下的稀有序列變化。野生型樣品在野生型對(duì)照的0.25℃范圍之內(nèi)。
‡ 野生型序列在探針下。調(diào)用野生基因型的分析擴(kuò)增數(shù)據(jù)或檢測(cè)在擴(kuò)增子之內(nèi)但是不在探針下的稀有序列變化（擴(kuò)增熔解曲線偏移雖然探針數(shù)據(jù)顯示是野生型）。只用擴(kuò)增熔解數(shù)據(jù)檢測(cè)出來(lái)的稀有突變需要測(cè)序判斷基因型（實(shí)驗(yàn)的外顯子<0.2）。
§由于突變或普通密碼子769多態(tài)的序列變化。遮蔽1bp 769探針區(qū)別WT13探針檢測(cè)到的其它序列變化的多態(tài)性。
¶用主要實(shí)驗(yàn)探針檢測(cè)外顯子的序列變化部分。
‖只有第二次實(shí)驗(yàn)的探針用于主要實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出來(lái)的序列變化的基因分型。根據(jù)主要探針與樣品的△Tm值選擇  探針，形象的用Tm標(biāo)線（圖2a，補(bǔ)充的圖1a和2a；http://jmd.amjpathol.org）或計(jì)算Tm值（補(bǔ)充表1-5；http://jmd.amjpathol.org）。如果選擇的探針不能基因分型序列變化（外顯子的0.2%），需要對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序，例：外顯子11（GAC→GAT）多態(tài)性。
**位置探針（L）：L10A611遮蔽，L10B620遮蔽，L11634遮蔽分別與主要實(shí)驗(yàn)探針WT10A，WT10B和WT11一起使用檢測(cè)序列變化。

外顯子10和11：多重突變熱點(diǎn)
     MEN2A和FMTC的主要突變位于外顯子10（密碼子609、611、618和620）和11（密碼子630和634），且野生型半胱氨酸的密碼子DNA序列“TGC”發(fā)生單核苷酸改變。外顯子10和11報(bào)道的序列變化>40（表1）。
     RET10外顯子的主要實(shí)驗(yàn)包括兩個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)和兩條探針。WT10A探針覆蓋了密碼子611和609，WT10B探針覆蓋了密碼子618和620（圖1a）。所有密碼子618和620突變的樣品在WT10A探針下有野生型序列且有和野生型對(duì)照樣品的Tm值相同（圖1b）。五個(gè)密碼子609和611樣品中的每一個(gè)都含有一個(gè)突變等位基因，比野生型等位基因的熔解溫度要低。相反的，WT10B探針，密碼子609和611突變樣品的Tm值和野生樣品的相同，但是每10個(gè)密碼子609和611突變樣品有一個(gè)突變等位基因，熔解溫度比野生型等位基因低（圖1e）。外顯子10所有的RET序列變化通過用高分辨率熔解曲線分析的標(biāo)準(zhǔn)化熔解曲線，派生圖或熒光信號(hào)的不同數(shù)據(jù)（圖1、c、d、f和g；數(shù)據(jù)沒有顯示）來(lái)檢測(cè)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了不在非標(biāo)記探針下的突變可以用擴(kuò)增熔解數(shù)據(jù)檢測(cè)出來(lái)（例：圖1中比較藍(lán)色突變的痕跡，b對(duì)c）。

圖1：檢測(cè)RET外顯子10序列變化的主要實(shí)驗(yàn)。a：RET10外顯子10的圖示，紅色方塊顯示密碼子609和611，藍(lán)色的方塊顯示密碼子610和620。外顯子10的主要實(shí)驗(yàn)用WT序列的兩個(gè)非標(biāo)記探針。如圖所示，WT10A探針檢測(cè)密碼子609和611突變，反之WT10B檢測(cè)密碼子618和620突變。每個(gè)圖中，顯示一式兩份三個(gè)野生型對(duì)照（WT，黑色痕跡），及一式兩份（紅色痕跡）兩個(gè)密碼子609和三個(gè)密碼子611突變樣品、五個(gè)密碼子618和620突變（藍(lán)色痕跡）。3個(gè)左面的圖是WT10A探針反應(yīng)的非標(biāo)記探針和擴(kuò)增子的高分辨率熔解數(shù)據(jù)，右面的3個(gè)圖是WT10B的數(shù)據(jù)。對(duì)于每個(gè)探針，最厚重的痕跡線與探針檢測(cè)的突變一起使用，稀疏的痕跡線只于擴(kuò)增子檢測(cè)的突變一起使用。b：WT10A探針數(shù)據(jù)的派生熔解圖。等位基因分為兩個(gè)Tm范圍，且每個(gè)范圍有預(yù)測(cè)的密碼子突變等位基因（609/611突變或618/620突變），與WT等位基因一起列出。c：WT10A探針與WT主要實(shí)驗(yàn)和標(biāo)記的外顯子10突變樣品的擴(kuò)增派生熔解曲線。d：同樣擴(kuò)增數(shù)據(jù)的不同平面圖。e：WT10B探針的數(shù)據(jù)的派生熔解平面圖。等位基因分為兩個(gè)Tm范圍，且每個(gè)范圍有預(yù)測(cè)的密碼子突變等位基因， 與野生型等位基因一起列出。f：WT10B探針與野生型主要實(shí)驗(yàn)和標(biāo)記的外顯子10突變樣品的擴(kuò)增派生熔解曲線。g：同樣擴(kuò)增數(shù)據(jù)的不同平面圖。

      在主要實(shí)驗(yàn)中用野生型探針識(shí)別每個(gè)探針下的野生序列，樣品Tm值與野生型對(duì)照等位基因Tm值相差±0.25℃（表3；補(bǔ)充表1；）。RET序列變化的樣品有一個(gè)等位基因，其Tm值小于野生型等位基因，△Tm值>0.25℃。限制在第二次實(shí)驗(yàn)中基因分型需要的特定突變探針的數(shù)目，△Tm值范圍用于安裝相似的△Tm值分組RET序列變化。△Tm值值的范圍用于快速生成Tm標(biāo)線，視覺上選擇第二次試驗(yàn)探針。例如：圖2a的WT10B探針數(shù)據(jù)顯示13個(gè)樣品通過Tm標(biāo)線，視覺上分為一個(gè)野生型組和兩個(gè)突變組。第一個(gè)突變組，包含密碼子618或620的TAC、TCC、TTC和TGG，△Tm值在3.3℃到5℃的△Tm范圍內(nèi)（圖2a；表3；補(bǔ)充表1；http://jmd.amjpathol.org）。這一組的樣品在第二次實(shí)驗(yàn)中MS10B的探針集1需要4個(gè)探針（圖2，b-e）。第二個(gè)突變組，包括密碼子618和620的 AGC、CGC和GGC突變，△Tm值在0.25℃到3.3℃的△Tm范圍內(nèi)。這個(gè)突變組在第二次實(shí)驗(yàn)中MS10B的探針集2需要3個(gè)探針（圖2，f-h）。相同的方法用于包含密碼子609和611突變的WT110A探針數(shù)據(jù)（表3；補(bǔ)充圖1；補(bǔ)充表2；http://jmd.amjpathol.org）。外顯子10的主要實(shí)驗(yàn)用的△Tm值來(lái)自于兩個(gè)外顯子10的野生型探針限制來(lái)自28至≤8基因型未知突變的可能基因型。
      為了減少第二次實(shí)驗(yàn)中基因分型突變所需的探針的數(shù)目，外顯子10的每個(gè)特定突變探針在致病密碼子范圍有相同的序列改變（表2）。一個(gè)致病密碼子的補(bǔ)充突變等位基因?qū)е屡c探針只有一個(gè)錯(cuò)配，且Tm值比有兩個(gè)錯(cuò)配（表2，b-h）的野生型等位基因高2℃-5℃ 。如果突變?cè)诓煌�的位置，突變等位基因與探針有三個(gè)錯(cuò)配，且熔解Tm值低于野生型（例，圖2 TGG突變，b-d，粉色痕跡）。如果突變與探針序列改變?cè)谕�一位置，但是不與探針互補(bǔ)，此時(shí)突變等位基因的Tm值接近于野生型等位基因的Tm值，因?yàn)檫@個(gè)等位基因與探針有兩個(gè)錯(cuò)配。分析時(shí)，如果與野生等位基因熔解曲線不相同，這些突變等位基因因?yàn)槿劢馇�線相似而被遮蔽（如：圖2g遮蔽的AGC和GGC，紅色和灰色的痕跡）。偶爾，一個(gè)突變等位基因和非互補(bǔ)特定突變探針會(huì)顯示比預(yù)期高的遮蔽熔解。例如：密碼子618（TGC→TCC）和620（TGC→TCC）突變比野生等位基因和MS618/620TAC和TTC探針（圖2， b和d，橙色痕跡）較穩(wěn)定（△Tm-1.7℃至-2.0℃）。即使如此，兩個(gè)雜合TTC突變通過與互補(bǔ)MS618/620TCC探針（△Tm-4.7℃）的較高的Tm值而容易區(qū)分（圖2c，橙色痕跡）。