Western Blot過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題及可能原因分析

背景高

膜沒(méi)有完全均勻濕透

使用100% 甲醇浸透膜5-10min

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數(shù)

阻斷不充分

增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）

二抗?jié)舛冗^(guò)高

降低二抗?jié)舛?/DIV>

檢測(cè)過(guò)程中膜干燥

保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象

曝光過(guò)度

縮短曝光時(shí)間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)

檢測(cè)抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無(wú)交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)

沒(méi)有陽(yáng)性條帶，或者陽(yáng)性條帶比較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間

酶失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說(shuō)明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，如果陽(yáng)性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒(méi)有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過(guò)設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性

一抗失效

選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

膜沒(méi)有完全均勻濕透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10Kd

選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間

甲醇濃度過(guò)高

過(guò)高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠

對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間

標(biāo)本中靶蛋白含量太低

增加標(biāo)本上樣量。

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長(zhǎng)時(shí)間放置

封閉過(guò)度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類(lèi)型

曝光時(shí)間過(guò)短

延長(zhǎng)曝光時(shí)間

條帶位置不對(duì)；或有非特異性條帶

色帶）

二抗的非特異性結(jié)合

增加一個(gè)對(duì)照：不加一抗，其他操作過(guò)程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來(lái)源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈的）

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過(guò)程及強(qiáng)度

抗體濃度過(guò)高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過(guò)大

降低上樣量

封閉劑中有聚集體

使用前過(guò)濾封閉試劑

HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體

HRP含量過(guò)高

降低酶聯(lián)二抗的濃度