ATP生物發(fā)光技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

 

   ATP是化學(xué)物質(zhì)三磷酸腺苷的簡稱，存在于所有的生物體中（從微生物到高等動物），ATP在細胞體內(nèi)主要作用是提供能量。鑒于ATP存在于所有生物體中，利用ATP發(fā)光檢測儀檢測ATP，可以間接地證明生物體的存在。隨著食品行業(yè)對食品衛(wèi)生質(zhì)量要求越來越高，而且ATP生物發(fā)光法在檢測食品微生物時簡單、快速且靈敏度高，因此近年來受到廣泛關(guān)注。

 

 

   ATP生物發(fā)光技術(shù)產(chǎn)生于20世紀70年代中期。1983年，Moyer^[1]等最早提出細胞內(nèi)源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數(shù)量。同年Gronroos^[2]等也證實該技術(shù)是一種可靠、靈敏度高的確定細胞活性度的檢測方法。20世紀80年代，英國人首先研制出ATP檢測儀檢測系統(tǒng)，隨后發(fā)展到歐洲、美國和日本。應(yīng)用范圍涉及食品加工、超市和飲食行業(yè)，檢測內(nèi)容包括微生物和食品殘渣。1998年，日本國會頒布了《關(guān)于食品制造過程管理高度化臨時措施法》，其中即包含了應(yīng)用ATP檢測儀檢測系統(tǒng)的內(nèi)容。1999年，日本還成立了ATP涂抹檢查研究會，專門研究該方法的使用效率和應(yīng)用領(lǐng)域，其內(nèi)容之一就是在食品衛(wèi)生監(jiān)測領(lǐng)域中，解決現(xiàn)場微生物的檢測問題。20世紀末，一些ATP檢測儀檢測系統(tǒng)及技術(shù)被引進我國，到目前為止，除個別省級衛(wèi)生監(jiān)督檢測單位裝備外，主要是在一些外資或合資企業(yè)中自行檢測使用。2002年，我國衛(wèi)生部頒發(fā)了食品加工企業(yè)HACCP實施指南，鼓勵食品加工企業(yè)引入ATP檢測系統(tǒng)。近年來，蟲熒光素酶已通過基因工程生產(chǎn)，價格大幅度降低，隨著相關(guān)儀器的小型化，ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會在國內(nèi)相關(guān)行業(yè)得到迅速普及^[3] 。

 

 

 

   ATP廣泛存在于各種活的生物體中，活的菌體中也含有ATP。細菌死亡后，在細胞內(nèi)酶的作用下，將很快被分解掉。ATP生物熒光檢測是基于生物發(fā)光體系的發(fā)光機理所設(shè)計，螢火蟲具有特殊的發(fā)光物質(zhì)——蟲熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級，處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子跳回到低能級時，即發(fā)出熒光光子。該光的強度與被檢測物質(zhì)中所含的ATP量成正比，利用高靈敏度的儀器測定光的強度進行定量分析。因此，通過測定樣品中ATP的濃度，即可推算出活菌數(shù)。生物發(fā)光法的檢測步驟大體包括：棉拭取樣、樣品萃取、添加熒光素和熒光素酶混合物、測定生物發(fā)光量、做出標(biāo)準曲線、求出濃度和活菌數(shù)。通常，細菌表層有細胞膜和細胞壁包裹，故樣品未經(jīng)處理是不能測定的。測定時需先將樣品與微生物用提取試劑混合，使細胞膜和細胞壁開孔，提取出ATP提取試劑是以表面活性劑為基質(zhì)的專用試劑。然后，再與熒光素和熒光素酶生物發(fā)光試劑作用，用熒光儀測定與發(fā)光試劑反應(yīng)的生物發(fā)光量^[4] 。

 

   菌落總數(shù)的測定，一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數(shù)。（以下圖片均來自于互聯(lián)網(wǎng)）

 

   ATP生物發(fā)光法的應(yīng)用范圍十分廣泛，現(xiàn)已應(yīng)用于食品行業(yè)的多個領(lǐng)域。研究表明，ATP生物發(fā)光法與標(biāo)準的細菌培養(yǎng)菌落計數(shù)法相比，二者具有良好的相關(guān)性(r=0.98) ^[7] ，但怎樣細分細菌種類有一定的難度,還需要做大量的工作。利用這種方法可以對食品原料、肉類、水產(chǎn)品、蔬菜、飲料、酒類、酸奶等中微生物的含量進行定量。此外，采用ATP生物發(fā)光法可快速、簡便地檢測食品生產(chǎn)環(huán)境的清潔度。對ATP 含量的檢測是以相對發(fā)光值(Relative Light Unit ,簡稱RLU)表示的。隨著RLU值的降低，微生物的檢出幾率也降低。實驗證明：如果將RLU值以100～1000作為界限，RLU值不滿100時，微生物檢出幾率為0，RLU值在100～1000范圍內(nèi)時，微生物檢出幾率為30%，RLU值超過1000時，微生物檢出幾率為96%。根據(jù)這一結(jié)果，在日常對食品生產(chǎn)設(shè)備或與食品密切接觸設(shè)備清潔度的檢測時，可以將RLU值不滿100時視為安全，RLU值在100～1000范圍內(nèi)時視為要引以重視和注意，RLU值超過1000時視為處于微生物污染的危險狀態(tài)^[8] ，因此ATP 生物發(fā)光法十分適合HACCP系統(tǒng)的清潔度檢測。此外，還可以用于酵母菌等對毒素的敏感性比較^[9] 。近年來，ATP生物發(fā)光技術(shù)在國內(nèi)外倍受推崇，在美、日等國食品行業(yè)的質(zhì)量檢測控制領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，有效促進食品生產(chǎn)企業(yè)提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，隨著此方法不斷改進和完善，生物發(fā)光法可望發(fā)展成為一種較為理想的微生物檢測方法而得到更廣泛的應(yīng)用，以不斷提高產(chǎn)品質(zhì)量，確保食品質(zhì)量安全。

 

 

[1] M JD, J H. Nucleoside triphosphate specificity of fireflyluciferase[J]. Analytical Biochemistry, 1983, 131(1): 187-189.

[2] GRONROOS M, MAENPAA J, NIEMINEN A L, et al. Correlation of steroid receptor contents with medroxyprogesterone and tamoxifen effects in endometrial cancer assayed by barin vitro ATP-bioluminescence method[J]. Journal of Steroid Biochemitry, 1983, 19(1): 194.

[3] 伍季，王燕，章建軍. ATP生物發(fā)光法快速檢測啤酒中的菌落總數(shù)[J]. 河南科學(xué)，2006，24 (1)：63-65.

[4] 劉炳智，朱蓓. A T P 生物發(fā)光法在微生物檢驗上的應(yīng)用[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，1999 ，(15 )1：29-30.

[5] 史帥. ATP 熒光法快檢系統(tǒng)實現(xiàn)細菌總數(shù)的快速檢測[J]. 食品安全導(dǎo)刊，2008，1：51-52.

[6] 周愛玉，羅金平，岳偉偉等. 手持式ATP 生物熒光檢測儀研制[J].2008，214：543-546.

[7] 舒柏華，孫丹陵，王勝利. 肉類食品細菌污染生物發(fā)光快速分析技術(shù)研究[J].中國公共衛(wèi)生，2003，19(4)：483-484.

[8] 王茁. ATP 熒光微生物檢測法在食品衛(wèi)生監(jiān)控領(lǐng)域中的應(yīng)用與展望[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2004 ，16（3）：266-267.

[9] S A, M-L D, P S. Use of ATP measurements by bioluminescence to quantify yeast's sensitivity against akiller toxin[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 495: 217-224.