Acumen eX3高內(nèi)涵細胞分析儀的細胞生物學應用（一）——人類基因組RNAi文庫篩選

得益于高通量技術(shù)的廣泛應用，在過去的幾年里關(guān)于基因組學、蛋白組學、細胞組學等“組學”的研究都得到了空前的發(fā)展。科學家們從來沒有像今天這樣能夠借助各種自動化儀器設備高速、高效地對復雜的生物學現(xiàn)象進行深入細致的分析。從以往對簡單的蛋白分子間相互作用的研究，到如今對整個基因組和所有細胞信號通路調(diào)節(jié)機制的探索，高通量細胞生物學概念的產(chǎn)生把傳統(tǒng)的細胞生物學研究從小規(guī)模、低效率模式提升至大規(guī)模并且精確高效的階段。其中高內(nèi)涵篩選技術(shù)就是高通量細胞生物學的一個典型的代表，結(jié)合計算機數(shù)據(jù)存儲和軟件分析的功能，高內(nèi)涵分析平臺能夠大規(guī)模、自動化的進行各種細胞水平實驗。

 

英國TTP LabTech公司推出的Acumen eX3高內(nèi)涵細胞分析平臺配備有405nm、488nm和633nm三種不同波長的固態(tài)激光發(fā)生器，兼容眾多的熒光染料。Acumen eX3具有全孔高速成像和多重熒光分析的能力，兼有CCD成像系統(tǒng)和流式細胞儀的優(yōu)點，能在10min內(nèi)完成對微孔板（包括96、384、1536孔板）的整板掃描。目前，該平臺已經(jīng)成功地應用于各種細胞水平的研究，包括對人類基因組RNAi文庫的篩選研究1－3，癌癥相關(guān)的研究2（包括細胞周期、細胞增殖、克隆形成、細胞毒性、凋亡、細胞粘附、血管生成、蛋白激酶等），以及干細胞分化的研究3。特別值得一提的是，AcumeneX3的高質(zhì)量成像優(yōu)勢在組織切片、動物模型（如線蟲，果蠅和斑馬魚）等系統(tǒng)生物學研究領(lǐng)域也備受推崇。在過去短短的幾年里，Acumen eX3已經(jīng)成為科研和制藥領(lǐng)域最為推崇的高通量細胞生物學的研究利器之一。

 

 

在RNAi技術(shù)突飛猛進的今天，它已經(jīng)滲透到了生命科學研究領(lǐng)域的每個角落。而科學家們也不再滿足于單個基因的RNAi研究，在這個高通量、追求效率的年代，基因組范圍的RNAi研究才能讓我們更快地了解更多新基因的功能。同時RNAi對基因沉默的巨大威力讓它也迅速成為了藥物篩選的新寵，并在藥物靶點基因的鑒定上發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)過科學家的不懈努力，如今RNAi藥物已經(jīng)從實驗室邁入臨床階段。

 

細胞周期調(diào)控的紊亂會引發(fā)多種疾病，特別是白血病和其他癌癥。因此，對人類細胞中參與周期調(diào)控的必需基因的研究不僅能加深對基礎生物學的了解，還可能為攻克癌癥帶來全新的診斷和治療方法。德國馬普細胞生物學和遺傳學研究所Ralf Kittler教授專注于細胞周期調(diào)控相關(guān)基因的研究，近來他的一篇將Acumen eX3用于在人類基因組RNAi文庫篩選細胞周期相關(guān)基因的研究成果也發(fā)表在了《Nature》上1。

 

為了鑒定Hela細胞中的參與細胞周期調(diào)控的基因，Kittler等在Acumen eX3平臺上開發(fā)出一種快速可靠的高通量分析方法，檢測基因組DNA的含量，作為細胞周期表型改變的初步檢測（圖1）。他們使用由內(nèi)切核酸酶制備的小干擾RNA（簡稱為esiRNA），集合了數(shù)百個針對單基因的靶點，這避免反復篩選過程，能迅速實現(xiàn)基因沉默，確保脫靶效應最低。整個實驗在384孔板上進行，用17,828個基因的esiRNA庫來轉(zhuǎn)染的細胞，72小時之后固定細胞，并用碘化丙啶（Propidium Iodide）染色，隨后用Acumen eX3高內(nèi)涵細胞分析儀進行掃描和分析。Acumen eX3的軟件能夠迅速定量細胞數(shù)目和subG1、G1、S、G2/M期、4N-8N和8N細胞的比率。

最終，研究人員發(fā)現(xiàn)了有1,351個參與細胞分裂過程的基因，其中包括已經(jīng)發(fā)現(xiàn)但未報道與細胞周期有直接關(guān)系的基因882個，尚未被基因組數(shù)據(jù)庫確定的基因252個，以及217個已經(jīng)報道與細胞分裂有關(guān)的基因。Acumen eX3的全孔掃描方式有效避免了一般的CCD高內(nèi)涵系統(tǒng)只能獲取每孔中極小部分細胞，從而無法獲得全細胞數(shù)進行均一化、數(shù)據(jù)可靠性下降的缺陷（細胞在培養(yǎng)過程中分布不均勻會引起檢測的誤差）。而流式細胞儀由于其實驗方法的復雜性（細胞需要重懸），且檢測速度較慢，整個實驗時間可能需要7個月。而使用Acumen eX3無需重懸細胞，實驗周期只有7天，其中使用Acumen eX3進行掃描和數(shù)據(jù)分析僅僅占了2.5天，并且獲得了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，模板化的分析方法避免了人工干預對實驗結(jié)果的影響。