Acumen eX3高內(nèi)涵細(xì)胞分析儀的細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用（二）——癌癥相關(guān)研究

 

高通量細(xì)胞生物學(xué)是指將自動(dòng)化儀器設(shè)備和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)整合，來(lái)回答傳統(tǒng)方法不能解決的問(wèn)題。它需要用到先進(jìn)的成像技術(shù)、化學(xué)試劑和生物學(xué)方法，快速、多通路地獲得細(xì)胞表型、功能和相互作用的信息。它的核心思想是盡可能多地獲得數(shù)據(jù)——無(wú)論是來(lái)源于大量樣本，還是采用“組學(xué)”的研究方式，同時(shí)不降低數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

 

英國(guó)TTP LabTech公司推出的Acumen eX3高內(nèi)涵細(xì)胞分析平臺(tái)配備有405nm、488nm和633nm三種不同波長(zhǎng)的固態(tài)激光發(fā)生器，兼容眾多的熒光染料。Acumen eX3具有全孔高速成像和多重?zé)晒夥治龅哪芰�，兼有CCD成像系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀的優(yōu)點(diǎn)，能在10min內(nèi)完成對(duì)微孔板（包括96、384、1536孔板）的整板掃描。目前，該平臺(tái)已經(jīng)成功地應(yīng)用于各種細(xì)胞水平的研究，包括對(duì)人類(lèi)基因組RNAi文庫(kù)的篩選研究1－3，癌癥相關(guān)的研究2（包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞毒性、凋亡、細(xì)胞粘附、血管生成、蛋白激酶等），以及干細(xì)胞分化的研究³。特別值得一提的是，AcumeneX3的高質(zhì)量成像優(yōu)勢(shì)在組織切片、動(dòng)物模型（如線蟲(chóng)，果蠅和斑馬魚(yú)）等系統(tǒng)生物學(xué)研究領(lǐng)域也備受推崇。在過(guò)去短短的幾年里，Acumen eX3已經(jīng)成為科研和制藥領(lǐng)域最為推崇的高通量細(xì)胞生物學(xué)的研究利器之一。

 

 

癌癥研究的主要目的就是為了提供攻克癌癥的治療手段，那么也就離不開(kāi)細(xì)胞水平的毒性、增殖與凋亡、侵襲遷移等分析，由于在眾多應(yīng)用方面高內(nèi)涵技術(shù)和癌癥研究直接相關(guān)，這也使得高內(nèi)涵技術(shù)在癌癥相關(guān)研究中廣泛應(yīng)用。Acumen eX3 作為高內(nèi)涵技術(shù)的革命性產(chǎn)品很好的將腫瘤學(xué)研究和高通量生物學(xué)結(jié)合起來(lái)，不僅應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋了包括蛋白激酶分析、細(xì)胞侵襲和遷移、細(xì)胞增殖、克隆形成、細(xì)胞毒性、凋亡、細(xì)胞粘附、血管生成等眾多癌癥研究的熱門(mén)領(lǐng)域4－7，而且還滿足了用戶在24至1536孔板上進(jìn)行的高通量細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，并提供全孔細(xì)胞的精確數(shù)據(jù)分析。下面我們就從幾個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域來(lái)介紹Acumen eX3在癌癥研究中的優(yōu)勢(shì)。

 

1.      細(xì)胞周期

細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂會(huì)引發(fā)多種疾病，特別是白血病和其他癌癥。因此，對(duì)人類(lèi)細(xì)胞中參與周期調(diào)控的必需基因的研究不僅能加深對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)的了解，還可能為攻克癌癥帶來(lái)全新的診斷和治療方法。

 

Acumen eX3微孔板細(xì)胞分析儀（TTP LabTech）提供了流式細(xì)胞儀無(wú)法比擬的細(xì)胞周期篩選通量。通�？稍�10分鐘內(nèi)讀取一整塊384孔板，并且同時(shí)進(jìn)行多重分析，如有絲分裂指數(shù)的確定。Acumen eX3能原位分析貼壁細(xì)胞，而不需要像流式細(xì)胞儀那樣重懸細(xì)胞，這就避免了細(xì)胞在重懸的時(shí)候因?yàn)樾螒B(tài)變化而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使用細(xì)胞通透性DNA染料可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期分析以及其他生物標(biāo)記物的多重分析。

圖1 對(duì)長(zhǎng)春堿處理細(xì)胞的細(xì)胞周期和有絲分裂指數(shù)的多重分析

 

2. 克隆形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于癌癥的臨床和機(jī)理研究中，人們以此來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞群體在體外的功能狀況。其中一些重要的研究領(lǐng)域就包括了細(xì)胞毒性評(píng)估、細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究以及預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)各種化學(xué)治療試劑的反應(yīng)。過(guò)去，克隆計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)是在半固體的瓊脂糖雙層系統(tǒng)上進(jìn)行的，需要在顯微鏡下一個(gè)一個(gè)地?cái)?shù)，非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且無(wú)可避免的引入了人為的主觀因素的影響。一般的高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)，由于景深有限，不能準(zhǔn)確分辨大體積的克�。欢�且它的成像面積較小，又不能對(duì)全孔進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

 

Acumen eX3 能夠自動(dòng)地對(duì)24 或96 孔板進(jìn)行高內(nèi)涵的全孔掃描，軟件獨(dú)有的體積算法能精確測(cè)量克隆大小。細(xì)胞經(jīng)過(guò)calcein-AM 染色后，可在選定的時(shí)間點(diǎn)來(lái)監(jiān)測(cè)克隆的生長(zhǎng)，精確區(qū)分孔內(nèi)含有指定細(xì)胞數(shù)量的克隆，這能幫助用戶區(qū)分細(xì)胞簇和克隆，從而精確計(jì)數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞克隆被認(rèn)為含有20 個(gè)以上的細(xì)胞（圖2，紅色），而細(xì)胞簇不足20 個(gè)細(xì)胞（圖2，綠色）。傳統(tǒng)的格子計(jì)數(shù)法對(duì)于某些克隆來(lái)說(shuō)就會(huì)顯得無(wú)計(jì)可施（如圖2中的克隆2）。而Acumen eX3 鑒定了孔中的所有熒光目標(biāo)，這也意味著所有克隆都能被準(zhǔn)確地鑒定和分類(lèi)。在表1中顯示了圖2中標(biāo)記的3 個(gè)克隆的面積和體積測(cè)量結(jié)果（表1）。通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，使用面積作為測(cè)量參數(shù)相對(duì)于使用體積作為測(cè)量參數(shù)，低估了克隆的尺寸。例如，克隆2 由于其形狀和在孔中的分布方向所致，使得它的體積/面積比要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于克隆1 和克隆3。

圖2Acumen eX3 軟件對(duì)細(xì)胞克隆的鑒定及分類(lèi)

表1  Acumen eX3 計(jì)算的3個(gè)克隆的相關(guān)參數(shù)

 

顯然Acumen eX3這種利用體積讀數(shù)來(lái)對(duì)細(xì)胞克隆形成進(jìn)行評(píng)估的方法，避免了由于細(xì)胞毒性等引起細(xì)胞在數(shù)目和外形上的不同而造成的誤差，無(wú)疑提供了一種優(yōu)異的檢測(cè)克隆形成的實(shí)驗(yàn)方法⁶。

 

3. 血管生成實(shí)驗(yàn)

血管生成（angiogenesis）是癌癥轉(zhuǎn)移所必需的條件，腫瘤的血管生成是指血管網(wǎng)絡(luò)的增殖，這些血管滲透到癌細(xì)胞周?chē)�，為之提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，并帶走廢物。腫瘤的血管生成實(shí)際受所釋放的生長(zhǎng)因子的調(diào)控。這些信號(hào)激活了宿主組織中的某些基因，翻譯生成的蛋白會(huì)促進(jìn)新血管的生長(zhǎng)。因而科學(xué)家一直寄希望于能夠通過(guò)干擾腫瘤的血管生成來(lái)治療癌癥。

 

Acumen eX3的大視野能力支持24或96多種規(guī)格的微孔板。在生長(zhǎng)因子刺激后，細(xì)胞用calcein-AM 染色，通過(guò)Acumen eX3掃描后，血管生成的數(shù)量就可輕松確定⁸。軟件會(huì)得到總的血管面積；也可以將圖像輸出，由Image Pro Plus進(jìn)行血管長(zhǎng)度以及分支數(shù)量的測(cè)定。

4. 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移是高度整合、復(fù)雜調(diào)控的過(guò)程，細(xì)胞遷移的調(diào)控異常涉及到癌癥、黃斑退化和糖尿病、傷口愈合等多種疾病。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，因此腫瘤細(xì)胞遷移的研究對(duì)癌癥的防止有著重要的意義。近年來(lái)，關(guān)于評(píng)估細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)方法越來(lái)越精細(xì)，取代了之前Boyden 小室方法。

Acumen eX3結(jié)合Oris™細(xì)胞遷移分析（http://www.platypustech.com）的專(zhuān)利技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在在微孔板上進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，利用獨(dú)特的細(xì)胞接種塞來(lái)產(chǎn)生一個(gè)能觀察細(xì)胞遷移和侵襲的檢測(cè)區(qū)域。硅膠塞插入96 孔板的每個(gè)孔中，接種后4-18 個(gè)小時(shí)，貼壁細(xì)胞附著在硅膠塞以外的區(qū)域，形成一個(gè)環(huán)。去除硅膠塞后，孔中心形成直徑2 mm的圓形區(qū)域沒(méi)有附著任何細(xì)胞，區(qū)域外的細(xì)胞會(huì)向內(nèi)遷移，此區(qū)域即可用于檢測(cè)細(xì)胞遷移的速率。

圖5 Oris™細(xì)胞遷移板在Acumen eX3 上進(jìn)行的分析，并支持多種熒光標(biāo)記。

 

由于Acumen eX3在成像面積和計(jì)數(shù)效率方面的優(yōu)勢(shì)，大大提高了整個(gè)實(shí)驗(yàn)的效率，96孔板掃描分析不超過(guò)10分鐘。更重要的是避免了傳統(tǒng)的劃痕法引入的人為操作誤差^9-10。