microRNA芯片高通量篩選發(fā)現(xiàn)miR-95通過抑制SNX1基因促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

 

microRNA是⼀類約22個核苷酸長度的非編碼RNA小分子，⼀般通過與mRNA的3‘UTR區(qū)域相互作用從而抑制相關(guān)基因的表達(dá)。據(jù)研究表明，microRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平上至少調(diào)控了三分之⼀的人類基因。目前最新的microRNA數(shù)據(jù)庫（miRBase）版本號是17.0（April 2011，www.mirbase.org），涵蓋了153個物種、共19724條成熟microRNA序列。雖然microRNA的研究進(jìn)展神速，但是大多數(shù)microRNAs在生理或病理過程中發(fā)揮作用的機制仍未被揭示出來。

 

結(jié)腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是世界第三大癌癥，雖然在過去幾十年中結(jié)腸癌的治療技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，但是結(jié)腸癌的分子病理機制仍未被了解清楚。過去的研究發(fā)現(xiàn)了⼀些蛋白編碼基因（例如：P53，APC，K-ras，DCC等）可能與結(jié)腸癌的形成有關(guān)，但是在結(jié)腸癌形成過程中發(fā)揮作用的microRNA卻⼀直沒有被發(fā)現(xiàn)。

 

在本文中，復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院黃朝暉博士在導(dǎo)師杜祥教授和上海市腫瘤研究所癌基因和相關(guān)基因國家重點實驗室何祥火研究員指導(dǎo)下利用基因芯片高通量篩選的方法，找到了影響結(jié)腸癌增殖速度的microRNA——miR-95，并鑒定了miR-95的下游靶基因SNX1。該研究成果發(fā)表在2011年3月的Cancer Research（影響因子8.234）上。基因芯片技術(shù)服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心（）完成。

 

 

研究小組首先選取了10對結(jié)腸癌組織和癌旁組織，用microRNA芯片（Agilent microRNA microarray）進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)49條有表達(dá)差異的microRNA。隨后從中選取了幾個microRNA用miRNA擬似物轉(zhuǎn)染分析實驗（miRNA mimics transfecJon assay）分析它們對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-95有最強的促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的能力。而以往也有報道，在多種腫瘤（結(jié)腸癌、肺癌、胰腺癌等）中能觀察到miR-95的過表達(dá)。這樣的結(jié)果表明，miR-95表達(dá)量的變化很有可能與細(xì)胞癌變過程有關(guān)。

 

用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，研究小組構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)miR-95的HCT-116和LoVo細(xì)胞系（兩種結(jié)腸癌細(xì)胞），通過細(xì)胞增殖實驗（cell proliferation assay）和克隆形成實驗（colony formation assay）發(fā)現(xiàn)，miR-95表達(dá)上調(diào)可顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。而用RNAi的方法降低miR-95的表達(dá)量則會降低結(jié)腸癌細(xì)胞的生長速度。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-95的LoVo細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的LoVo細(xì)胞注射到裸鼠中觀察腫瘤細(xì)胞的生長速度，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-95的腫瘤細(xì)胞生長更快。這樣就從體外實驗和體內(nèi)實驗兩個方面證實miR-95能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

 

綜上，該研究小組通過microRNA芯片篩選到了在結(jié)腸癌中差異表達(dá)的49種microRNA，通過microRNA擬似物轉(zhuǎn)染分析實驗確定miR-95為初步的研究對象。隨后通過⼀系列體內(nèi)、體外實驗證實，miR-95確實能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

 

 

microRNA⼀般通過抑制下游基因來發(fā)揮作用，由于前面的研究結(jié)果表明miR-95促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，那么它所抑制的下游基因應(yīng)該是腫瘤抑制基因。研究小組用TargetScan預(yù)測了一些miR-95的靶基因，采用熒光素酶報告基因分析（luciferase reporter assay）發(fā)現(xiàn)，SNX1受miR-95抑制最為顯著。而在SNX1的3‘UTR區(qū)域引入突變之后，SNX1就不被抑制了。Western實驗也顯示，在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-95，那么SNX1蛋白量降低；而抑制miR-95，SNX1蛋白含量則會升高。這些結(jié)果都表明：SNX1是miR-95的下游靶基因。

 

在結(jié)腸癌細(xì)胞中用siRNA抑制SNX1的表達(dá)能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，這⼀現(xiàn)象和增加miR-95的表達(dá)量⼀致。而共轉(zhuǎn)染實驗顯示，在敲除了SNX1的細(xì)胞株中，再抑制miR-95的表達(dá)量，也不能使細(xì)胞增殖速度回到正常水平。而在miR-95高表達(dá)、細(xì)胞增殖速度很快的細(xì)胞系中，增加SNX1的表達(dá)量則能使細(xì)胞增殖速度下降。這些現(xiàn)象表明，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，miR-95通過抑制SNX1來促進(jìn)細(xì)胞增殖。

 

綜上所述，該研究利用microRNA芯片篩選得到了影響結(jié)腸癌增殖速度的microRNA——miR-95，并進(jìn)⼀步闡明了miR-95在結(jié)腸癌中的功能和分子機制，提示microRNA在結(jié)腸癌中扮演癌基因角色。該研究對于結(jié)腸癌分子機制的進(jìn)⼀步揭示和藥物開發(fā)具有重要意義。

 

Huang Z, Huang S, Wang Q, Liang L, Ni S, Wang L, Sheng W, He X, Du X. MicroRNA-95 promotes cell proliferation and targets sorting Nexin 1 in human colorectal carcinoma. Cancer Res. 2011, 71(7):2582-9.  （影響因子8.234）

使用服務(wù)種類：Agilent miRNA芯片服務(wù)