黃體生成素（LH）ELISA試劑盒使用說(shuō)明

黃體生成素（LH）ELISA試劑盒使用說(shuō)明

 (德國(guó)DRG：EIA-1289)

1、 應(yīng)用范圍

DRG公司的LH酶聯(lián)免疫吸附試劑盒可用于血清中黃體生成素（LH）的定量檢測(cè)。此檢測(cè)試劑盒僅供體外診斷用。

2、前言說(shuō)明

在受到下丘腦釋放的黃體生成素釋放激素（LH-RH或者Gn-RH）的影響下，男性和女性的垂體前葉都可以產(chǎn)生LH（黃體生成素）。在男性中，LH也叫做促間質(zhì)細(xì)胞激素（ICSH），它是一種分子量大約為30000道爾頓的糖蛋白。它是由兩條不同的氨基酸鏈通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合形成的復(fù)合物，一條α鏈，一條β鏈。α鏈與在人促甲狀腺激素（TSH）、卵泡刺激素（FSH）和人絨毛膜促性腺激素中找到的α鏈糖蛋白類(lèi)似。這些激素的不同主要是由于他們?chǔ)骆湹陌被�酸組成不同所造成的，這也使它們產(chǎn)生了不同的免疫學(xué)功能。男性中LH的分泌是間歇性的，它的基本功能是刺激間質(zhì)細(xì)胞（萊迪希細(xì)胞）分泌睪酮。婦女體內(nèi)LH濃度的變化會(huì)受到正常月經(jīng)復(fù)雜排卵循環(huán)的影響，這也依賴(lài)于沿性腺-下丘腦-垂體軸的一系列激素活動(dòng)。排卵前孕酮和雌二醇水平的降低啟動(dòng)了每一個(gè)月經(jīng)周期。隨著激素水平的降低，下丘腦就增加促性腺激素釋放激素（GnRF）的分泌，它可依次刺激垂體增加FSH的生產(chǎn)和分泌。增加的FSH水平在卵泡階段可刺激一些卵泡的成熟，其中的一個(gè)卵泡就會(huì)成熟為含卵子的卵泡。隨著卵泡的發(fā)育，雌二醇就開(kāi)始分泌，剛開(kāi)始時(shí)很慢，但經(jīng)過(guò)12或13天的正常循環(huán)后它就開(kāi)始迅速增加。因?yàn)榇贵w的直接刺激和增加的GnRF和FSH水平，雌二醇的就開(kāi)始迅速增加，隨之LH就開(kāi)始釋放了。而這些事件正好組成了排卵前期。在LH達(dá)到最高水平后，排卵作用大約會(huì)持續(xù)12到18個(gè)小時(shí)。排卵后就會(huì)形成可分泌孕酮和雌激素（這兩種激素是LH的兩個(gè)反饋調(diào)節(jié)物）的黃體。黃體期迅速的緊隨排卵期而來(lái)，黃體期明顯表現(xiàn)為高孕酮水平，雌二醇第二增加，低LH和FSH水平。低LH和FSH水平是沿下丘腦-垂體軸雌二醇和孕酮負(fù)反饋反應(yīng)的結(jié)果。受孕后，胚胎的發(fā)育可產(chǎn)生hCG，hCG使得黃體繼續(xù)產(chǎn)生孕酮和雌二醇。如果沒(méi)有受孕，黃體就會(huì)退化，相應(yīng)的孕酮和雌二醇水平就會(huì)降低，從而導(dǎo)致了月經(jīng)的形成。隨著這些激素低激素水平的形成，下丘腦就又再次開(kāi)始一月經(jīng)周期患性腺機(jī)能退減的病人，其血清LH的濃度會(huì)增加。由于卵巢的發(fā)育不成熟、原發(fā)性的卵巢功能衰竭、多囊卵巢疾病或絕經(jīng)等原因，女性體內(nèi)類(lèi)固醇激素的分泌會(huì)減少，而且在這些情況下，LH的分泌沒(méi)有受到調(diào)節(jié)。在男性中，但睪丸發(fā)育不正�；虼嬖跓o(wú)睪畸形時(shí)，也同樣會(huì)失去調(diào)節(jié)激素。在原發(fā)性睪丸衰竭和克氏綜合征患者中，盡管在雄性激素持續(xù)分泌的情況下LH濃度沒(méi)有必要提高，但我們也可發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在著高濃度的LH。在腎衰竭、肝硬化、甲狀腺功能亢進(jìn)和嚴(yán)重饑餓的情況下，LH的濃度也可出現(xiàn)提高。垂體前葉激素的分泌不足也可能導(dǎo)致低LH水平。正如人們所預(yù)測(cè)的，低LH水平可能導(dǎo)致男性和女性不育。雖然LH的低水平在垂體前葉對(duì)GnTH刺激反應(yīng)失效的情況下也會(huì)出現(xiàn)，但由于下丘腦GnRH分泌的降低，LH的水平就有可能降低。因此低LH水平可表明垂體或下丘腦存在功能障礙，但具體的問(wèn)題根源必須通過(guò)其它實(shí)驗(yàn)確定。在下丘腦、垂體或性腺功能障礙的鑒別診斷中，LH濃度的檢測(cè)常與FSH一起進(jìn)行檢測(cè)（以為兩者的功能緊密相連）。此外，激素的水平也可用來(lái)確定是否絕經(jīng)、計(jì)算排卵時(shí)間和監(jiān)測(cè)內(nèi)分泌治療效果。

3、實(shí)驗(yàn)原理

   DRG公司的LH酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測(cè)孔包被有能結(jié)合LH分子上獨(dú)特抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性LH的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過(guò)氧化物酶的抗LH抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。辣根過(guò)氧化物酶符合物的總量與樣本中LH的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強(qiáng)度與病人樣品中LH的濃度成正比。

4、試劑盒組成:

1)      微量反應(yīng)板，1塊 ( 96孔)，包被了抗LH的單克隆抗體。

2)      標(biāo)準(zhǔn)系列:6支，凍干，1ml，濃度: 0,10,20,40,100,200mIU/ml

3)      酶聯(lián)物，1支，11ml，辣根過(guò)氧酶標(biāo)記的抗LH抗血清，0.3%的Proclin作為防腐劑。 

4)      底物液，14ml (TMB)

5)      終止液:1支，0.5M H₂SO₄, 14ml，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。

5、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）

1）酶標(biāo)儀

2）精確移液器，25；50；100μl.

3）蒸餾水

4）吸水紙

5）計(jì)時(shí)器

6）半對(duì)數(shù)紙

6、儲(chǔ)存條件

   未開(kāi)啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過(guò)期試劑，酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開(kāi)，必須將它小心地嚴(yán)封起來(lái)。如果包被板的包裝被打開(kāi)，其免疫活性在6周內(nèi)穩(wěn)定，但前提是必須將它密封在裝有干燥劑的袋子里。

7、試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將所有試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。

標(biāo)準(zhǔn)品：在每支凍干粉的標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.0ml蒸餾水重新配置標(biāo)準(zhǔn)品。注意：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放2個(gè)月，要想存放更長(zhǎng)的時(shí)間則應(yīng)凍存于-20℃的環(huán)境下。

8、樣品

此實(shí)驗(yàn)將用到血清，請(qǐng)不要使用易溶血、黃疸血和脂血樣品，注意：含疊氮鈉的樣品不可用于此實(shí)驗(yàn)。

8.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝固，室溫離心分離血清。未完全凝血前請(qǐng)勿離心，接受了抗凝劑治療的病人可能需要更長(zhǎng)的凝血時(shí)間。

8.2樣品儲(chǔ)存

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前應(yīng)用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放48小時(shí)。如果將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下則可將其存放更長(zhǎng)時(shí)間（只可凍融1次）。解凍的樣本在實(shí)驗(yàn)之前必須要上下倒置幾次。

8.3樣品的稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>

在第一次實(shí)驗(yàn)中，樣本濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品應(yīng)當(dāng)在實(shí)驗(yàn)前用零緩沖液進(jìn)行稀釋。在計(jì)算濃度時(shí)，應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。例子：

a）按1：10稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US> 10μL的血清+90μL的零緩沖液（充分混合）。

b）按1：100稀釋?zhuān)?SPAN lang=EN-US>10ul稀釋好的a）+90μL的零緩沖液（充分混合）。

9、實(shí)驗(yàn)步驟

所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都必須做雙份檢測(cè)以保證它們的檢測(cè)條件都一樣。每次檢測(cè)都必須有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1)      將所需數(shù)目的板條置于板架上。

2)      將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和血清樣本分別25μl加入到相應(yīng)的微孔中，每次都得使用新的取樣吸頭。

3)      加100μl的抗LH酶聯(lián)物于各孔中。

4)      混勻10秒,此步驟中完全混勻很重要。

5)      室溫溫育(22℃)30分鐘。

6)      棄去孔內(nèi)的反應(yīng)液。用蒸餾水洗板5次（每孔400ul），在吸水紙上把板拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和精密度。

7)      依原先加樣順序,每孔加100μl底物液。

8)      室溫(22℃)溫育10分鐘。

9)      按加底物液順序,每孔加50μl終止液于各孔中。

10)  加終止液后10分鐘內(nèi)在450nm波長(zhǎng)讀吸光度。

10、結(jié)果計(jì)算

1)      計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)      用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對(duì)其相應(yīng)的濃度值（mIU/ml）進(jìn)行標(biāo)繪，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

3)      用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上確定其相應(yīng)的濃度。

4)      自動(dòng)計(jì)算方法：說(shuō)明書(shū)上的結(jié)果是用四參數(shù)計(jì)算得到的，其它的歸納方法可能會(huì)給出稍微不同的結(jié)果。

5)      樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀取。樣品中LH濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋?zhuān)�任何稀釋了的樣品在�?jì)算時(shí)都必須將相應(yīng)的稀釋因子考慮進(jìn)去。

11、正常值

強(qiáng)烈建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都確定自己的正常值范圍和不正常值范圍。

用DRG公司的LH ELISA試劑盒對(duì)明顯健康人群進(jìn)行一研究，得到如下結(jié)果：