組胺ELISA試劑盒使用說明

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組胺ELISA試劑盒使用說明

（德國IBL：RE59221）

1、應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人血漿和尿液中組胺的體外定量檢測。深化此實(shí)驗(yàn)可用于細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。

2、前言說明

組胺（β-咪唑乙胺）是人體中最重要的介質(zhì)，它主要存在于過敏反應(yīng)的起始階段（速發(fā)型過敏）。組胺是由組胺酸經(jīng)脫氨基作用產(chǎn)生的。組胺幾乎存在于機(jī)體的所有組織中，主要儲存于柱狀細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的異染性顆粒中。組胺通常都是以無活性的復(fù)合體性存在，只有當(dāng)需要的時候才會釋放。像其它的介質(zhì)一樣，組胺不僅能調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)的各種臨床癥狀，也可以調(diào)節(jié)終止過敏反應(yīng)的一系列效應(yīng)。組胺在組織中的生物活性是通過三種受體來完成的，它們分別是H1，H2和H3受體。臨床檢測組胺的方法有：定量檢測各種速發(fā)型過敏反應(yīng)中嗜堿性白細(xì)胞釋放組胺的量，也可以檢測過敏藥物治療后各種體液（血漿，尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清）中組胺的量。

3、實(shí)驗(yàn)原理

此ELISA試劑盒利用的是競爭法的原理。樣品中未知量的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭性結(jié)合到包被在微孔中的抗體結(jié)合位點(diǎn)上。溫育后洗板以終止競爭反應(yīng)。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成反比。樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。

4、儲存與穩(wěn)定性

試劑盒必須在2-8℃的環(huán)境下運(yùn)輸和儲存，避免太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。如果將包被板密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下時，試劑在有效期內(nèi)穩(wěn)定。

5、樣品的采集與儲存

血漿（EDTA，肝素）

按照靜脈穿刺的常規(guī)注意事項(xiàng)采集樣品，血液樣品自采集到實(shí)驗(yàn)時都必須保證其化學(xué)完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品。混濁的樣品應(yīng)當(dāng)在實(shí)驗(yàn)開始前離心以除去所有的顆粒性物質(zhì)。
儲存	2-8℃	≤-20℃	≤-70℃	避免太陽直射，避免反復(fù)凍融。
穩(wěn)定性	5小時	3個月	2年	避免太陽直射，避免反復(fù)凍融。

尿液

實(shí)驗(yàn)必須使用自然產(chǎn)生的尿液，也可使用24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液。收集病人24小時內(nèi)產(chǎn)生的尿液，并混合于含10-15ml 6N HCl防腐劑的容器中。為了計算結(jié)果，請確定尿液的總體積。實(shí)驗(yàn)開始前請先將樣品離心。
	自然的尿液	酸化尿液		避免太陽直射，避免反復(fù)凍融。
儲存	2-8℃	2-8℃	≤-20℃
穩(wěn)定性	8小時	3天	6個月

細(xì)胞培養(yǎng)上清

使用細(xì)胞培養(yǎng)上清作樣品，一般沒特殊注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)的組胺濃度可能稍微要高些。

全血

全血中組胺釋放量的檢測必須用肝素化全血，具體信息請見相應(yīng)的說明書（RE95000）

6、試劑盒成分

注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分

數(shù)量	標(biāo)記	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了羊抗兔抗血清。
1×5ml	ANTISERUM	組胺抗血清，藍(lán)色，即用，內(nèi)含：兔抗血清、Tris緩沖液和0.01%的硫柳汞
1×75ul	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物，200倍濃縮，內(nèi)含辣根過氧酶標(biāo)記的組胺。
7×0.4ml	CAL P A-G LYO	血漿標(biāo)準(zhǔn)品A-G，凍干，用于血漿樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺、人血漿。具體濃度請見試劑瓶標(biāo)簽或質(zhì)控單。
2×0.4ml	CONTROL P1+2 LYO	血漿質(zhì)控1+2，凍干，內(nèi)含：組胺、人血清。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽。
1×2.0ml 5×0.25ml	CAL U/C A-F	尿液/細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)品A-F，0;2.7;8.1;24.3;73;219ng/ml,即用，用于尿液和細(xì)胞培養(yǎng)樣品的定標(biāo)。內(nèi)含：組胺和0.1M的HCl。
2×0.25ml	CONTROL U/C 1+2	尿液質(zhì)控1+2，即用，內(nèi)含：組胺、人尿液（酸化的）。具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽。
1×2.25ml	ACYLREAG	�；噭�，即用，內(nèi)含：DMF
1×60ml	ASSAYBUF CONC	檢測緩沖液，5倍濃縮，內(nèi)含Tris緩沖液、吐溫、BSA和0.05%的硫柳汞。
1×50ml	WASHBUF CONC	洗滌液，20倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液、吐溫和0.1%的硫柳汞。
1×10ml	INDICATORBUF	指示緩沖液，紫色，即用，內(nèi)含：Tris緩沖液、苯酚（pH＜7.5時顏色會發(fā)生改變＝和0.1%的硫柳汞。
1×12ml	TMB SUBS	TMB底物液，即用，內(nèi)含TMB、緩沖液和穩(wěn)定劑。
1×12ml	TMB STOP	TMB終止液，即用，1M的H₂SO₄。
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供

1）移液器，體積：10;20;50;100;1000ul

2）試管（12×75mm）

3）試管架

4）振蕩器

5）旋渦混合器（500rpm）

6）帶儲器的8道移液器

7）洗滌瓶，自動或半自動洗板機(jī)

8）酶標(biāo)儀（參考波長：600-650nm）

9）蒸餾水或去離子水

10）吸水紙、取樣吸頭和計時器

8、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說明

注意	96人份的試劑盒可分成三份分別進(jìn)行檢測，下述體積為檢測32人份時所需要的體積。

8.1凍干或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋/溶解	成分		稀釋劑	比例	備注	儲存	穩(wěn)定性
20ml	檢測緩沖液	100ml	蒸餾水	1：5		2-8℃	2周
15ml	洗滌液	300ml	蒸餾水	1：20	18-25℃將晶體溶解掉	2-8℃	4周
	血漿標(biāo)準(zhǔn)品	0.4ml	蒸餾水		靜置15min,混合時無泡沫	-20℃	1個月
	血漿質(zhì)控品	0.4ml	蒸餾水		靜置15min,混合時無泡沫	-20℃	1個月
10ul(*)	酶聯(lián)物	2ml	檢測緩沖液	1:200	臨時配置,只能使用一次	18-25 ℃	30分鐘

(*)在稀釋前,確保塞子內(nèi)無殘留液體.

8.2樣品的稀釋

樣品中組胺濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品,應(yīng)當(dāng)在酰化前用相應(yīng)的稀釋液稀釋,尿液樣品用0.1M的HCl,血漿樣品用樣品稀釋液（Cat.no. KEHP711）,試劑盒內(nèi)未提供。

8.3樣品的�；�

用試管準(zhǔn)備樣品

注意	不能血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酰化尿液或細(xì)胞培養(yǎng)樣品中組胺的濃度,也不能用U/C標(biāo)準(zhǔn)曲線確定�；獫{樣品中組胺的濃度.

8.3.1血漿

1	將血漿標(biāo)準(zhǔn)品、血漿質(zhì)控品和病人樣品分別100ul加入到相應(yīng)的試管中。
2	在每一試管中加入100ul指示緩沖液，旋渦混合。
3	在每一試管中加入20ul�；噭�，加入�；噭┖罅⒓葱郎u混合。
4	將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。
5	在每一試管中加入750ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。

8.3.2尿液，細(xì)胞培養(yǎng)上清

1	將U/C標(biāo)準(zhǔn)品、尿液質(zhì)控品和病人尿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清分別50ul加入到相應(yīng)的試管中。
2	在每一試管中加入50ul指示緩沖液，旋渦混合。如果指示劑變成無色，說明溶液的pH值很低，樣品中含有很多酸性物質(zhì)。在這種情況下，再向試管中加入50ul指示緩沖液直至溶液略帶微紅。
3	在每一試管中加入10ul酰化試劑，加入酰化試劑后立即旋渦混合。
4	將試管蓋好，室溫（18-25℃）溫育30分鐘。
5	在每一試管中加入2000ul已稀釋好的檢測緩沖液，旋渦混合。

注意：�；幚砗玫臉悠房稍�2-8℃下存放一晚，-20℃環(huán)境下可存放2天。

9、實(shí)驗(yàn)步驟

1	將酰化處理過的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣品分別50ul加入到相應(yīng)的微孔中。
2	在每一微孔中加入50ul臨時配置好的酶聯(lián)物。
3	在每一微孔中加入50ul組胺抗血清。
4	蓋板，振蕩器（500rpm）上室溫溫育3小時。
5	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用250ul稀釋好的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6	如果有條件的話，可以用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液時，每孔的時間間隔應(yīng)當(dāng)相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
7	在每一微孔中加入100ul TMB底物液。
8	血漿：振蕩器（500rpm）上室溫溫育40min。尿液/細(xì)胞培養(yǎng)上清：振蕩器（500rpm）上室溫溫育20min。
9	在每一微孔中加入100ul TMB終止液以終止底物反應(yīng)。輕輕振板使溶液混合均勻。
10	加終止液后15min內(nèi)450nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm）