非損傷微測技術測定液泡H+流速的方法
液泡膜H+運輸的傳統(tǒng)測定方法是通過pH熒光染料進行體外檢測完成的。然而，該方法中高純度的液泡膜分離復雜，且對微弱的H+實時監(jiān)測的靈敏度不夠，成為影響研究人員使用的原因。近年來，非損傷微測技術（NMT）已經廣泛地應用于電生理研究中。NMT具有非損傷、高靈敏度和實時監(jiān)測整個過程的優(yōu)點。迄今為止，雖然通過NMT已經測定了甜菜液泡的Ca2+流，但還沒有對液泡H+流速的測定報道。因此，建立液泡以及細胞膜系統(tǒng)H+流速測定的方法，對研究質子的運動和膜蛋白活性具有重要意義。
2011年，中科院植物所李銀心研究組對非損傷微測技術（NMT）測定液泡H+流進行了方法上的若干修正，使得NMT可以更準確地對液泡H+流進行測定。同時，研究中使用新建立的體系測定NaCl應激下轉基因煙草TS15和WT煙草的液泡H+流速差異，并用NMT方法測定液泡膜上H-ATPase和PPase的活性。研究首先根據NMT的可視化測定的特性，簡化了液泡提取方法，省略了傳統(tǒng)檢測中繁瑣的超速離心的步驟。在200mM NaCl脅迫下，H+外流增加，但是TS15的H+外流要顯著強于WT的外流，說明在轉基因植株中NHX1具有更高的活性。在200mM NaCl條件下施加ATP和PPi，液泡△H+流速的變化反映H-ATPase和PPase的活性大�。谎芯勘砻�，在施加ATP后，轉基因煙草液泡表現出更大的△H+流速；該結果說明轉基因植株比WT植株在200mM NaCl條件具有更高的V-ATPase活性。同時，用傳統(tǒng)方法計算H-ATPase和PPase酶活結果也證實了NMT測定的準確性。與傳統(tǒng)熒光方法相比，NMT從操作的流程，結果精度和結論的信息量上都具有更大優(yōu)勢。
本研究建立和修正了一種適合和精確的液泡H+流速的測定方法。用離子流差異還可以反映更多的生理特征，是一種可以替代傳統(tǒng)V-ATPase和PPase的活性測定方法的新手段。這種簡單的方法將來能夠廣泛地進行亞細胞和細胞器水平離子流速的檢測和分析。
參考文獻：Chen XY, et al. Analytical Biochemistry, 2011, 418: 295–297.
關鍵詞：非損傷微測技術，H+流速，SeNHX1，液泡
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