LaVision雙光子顯微鏡-呼吸道網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元活動(dòng)

Glycinergic interneurons are functionally integrated into the inspiratory network of mouse medullary slices

Stefan M. Winter & Jens Fresemann & Christian Schnell & Yoshitaka Oku & Johannes Hirrlinger & Swen Hülsman

 

摘要：呼吸道網(wǎng)絡(luò)中的神經(jīng)元活動(dòng)功能性地依賴(lài)于抑制性突觸傳遞。我們使用雙光子顯微鏡分析了獨(dú)立吸氣“pre-Bötzinger”復(fù)合物驅(qū)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)律性切片。通過(guò)在吸氣相關(guān)的呼吸過(guò)程中分別升高或降低細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)自由鈣離子的濃度，我們識(shí)別出吸氣（96%）和“緊張性”呼氣（4%）神經(jīng)元。而且，在GlyT2啟動(dòng)子控制下表達(dá)EGFP的BAC轉(zhuǎn)基因的小鼠中，鈣離子成像的50%的吸氣神經(jīng)元被甘氨酸化。切片中甘氨酸化神經(jīng)元的吸氣過(guò)程通過(guò)整個(gè)細(xì)胞記錄的形式確認(rèn)。我們同樣發(fā)現(xiàn)了接受來(lái)自其它甘氨酸化神經(jīng)元相位抑制的甘氨酸化神經(jīng)元。我們的鈣離子數(shù)據(jù)表明在節(jié)律性切片中的“pre-Bötzinger”復(fù)合物驅(qū)動(dòng)網(wǎng)絡(luò)中的甘氨酸化神經(jīng)元包含了大量的吸氣神經(jīng)元。

 

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    野生型和在甘氨酸化神經(jīng)元中表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的BAC（GlyT2-EGFP）轉(zhuǎn)基因小鼠被飼養(yǎng)在大學(xué)醫(yī)院Göttingen的動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施中，并按照德國(guó)生理學(xué)會(huì)、lower saxony州和德意志聯(lián)邦共和國(guó)的相關(guān)指導(dǎo)進(jìn)行喂養(yǎng)。野生型和BAC（GlyT2-EGFP）轉(zhuǎn)基因型小鼠被用于制備雙光子激發(fā)顯微鏡切片，只有BAC（GlyT2-EGFP）轉(zhuǎn)基因小鼠被用于完整細(xì)胞記錄和免疫組織化學(xué)研究。

 

雙光子激發(fā)顯微鏡的鈣離子成像

    腹側(cè)呼吸列的鈣離子成像由基于商業(yè)掃描頭（TriM Scope，LaVision BioTec，Bielefeld，Germany）的用戶定制的雙光子顯微鏡實(shí)現(xiàn)。在這個(gè)掃描頭中，脈沖紅外激光束可以被分解為高達(dá)64個(gè)一連串的焦點(diǎn)，在沒(méi)有增加光損傷的同時(shí)增加單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射熒光的數(shù)量。掃描頭被安裝在一個(gè)固定載物臺(tái)的正置顯微鏡(Axioscope FS2, Zeiss, Oberkochen, Germany)上，使用X40（0.8NA）或X63（1.0NA）的水浸物鏡(Zeiss, Oberkochen, Germany)。雙光子激發(fā)通過(guò)一個(gè)裝配了寬帶光學(xué)器件的Ti：Sa激光器(MaiTai BB, Spectra Physics, Darmstadt, Germany)獲得。對(duì)于釋放熒光的場(chǎng)檢測(cè)，我們使用CCD相機(jī)(Ixon 885 Andor Technology, Belfast, Northern Ireland, or PCO; Sensicam QE; Kehlheim, Germany) 快速鈣離子成像我們使用多束激光模式(16 或32 束)，掃描場(chǎng)為200 X 200μm (Ixon camera) or 170 X 220μm (Sensicam QE)。曝光時(shí)間為25–40 ms (4×4 binning=255×256 pixel) ，采樣頻率為10 到 30 Hz. 為了獲取更高的分辨率，激發(fā)光束增加到64束，以長(zhǎng)積分時(shí)間的非像素聯(lián)合模式成像。激光能量用掃描頭中的半波板和偏振層板控制，以“ImSpector”成像軟件(LaVision BioTec, Bielefeld, Germany)控制,  10μm 步長(zhǎng)的3D堆棧使用一個(gè)piezo-focus (Physik Instrumente, Karlsruhe, Germany)來(lái)確定深達(dá)100μm的呼吸神經(jīng)元的空間分布。 組織更深處的細(xì)胞無(wú)法確認(rèn)邊界。顯微鏡也裝配了兩個(gè)光電倍增器(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu,Japan)用于非掃描熒光檢測(cè)，用于高分辨率掃描和1μm的z軸堆棧 (Fig. 2).

 

Fig. 1節(jié)律性切片中呼吸神經(jīng)元的雙光子激發(fā)顯微圖像。

A由多焦點(diǎn)雙光子激發(fā)顯微鏡觀察到的俄勒岡綠BAPTA1-AM (OGB-1-AM) 標(biāo)記的位于腹側(cè)呼吸列中的神經(jīng)元。b.一次較大的呼吸活動(dòng)：ΔF圖像在C中型號(hào)標(biāo)記的時(shí)刻獲取，展示了5個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞（箭頭處）中的鈣離子濃度變化（橙色）。c 同時(shí)記錄了群場(chǎng)勢(shì)能(∫)和細(xì)胞內(nèi)自由細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子瞬變。C中的跟蹤曲線表示了來(lái)自5個(gè)呼吸神經(jīng)元（a、b中箭頭處）的鈣離子變化(ΔF/F0)。d.俄勒岡綠BAPTA1-AM標(biāo)記的呼吸神經(jīng)元。e. 交叉區(qū)域(CC)呼吸神經(jīng)元鈣離子信號(hào)的假彩圖。紅色表示吸氣神經(jīng)元 (CC>0.8)，藍(lán)色表示一個(gè)呼氣神經(jīng)元的吸氣抑制 (CC<−0.3)。f.d和e中表明的三個(gè)神經(jīng)元鈣離子變化(ΔF/F0)及場(chǎng)勢(shì)能(∫)的同步記錄

g循環(huán)觸發(fā)的十次連續(xù)呼吸活動(dòng)的與f中數(shù)據(jù)同樣的平均值

Fig. 2 延髓尾段中EGFP標(biāo)記的甘氨酸化神經(jīng)元的分布

a–c 概觀了BAC(GlyT2-EGFP)-小鼠EGFP標(biāo)記的甘氨酸化神經(jīng)元 (a) 和延髓尾段中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的表達(dá) (b). ChAT抗體使用Cy5結(jié)合的熒光二抗通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)。C中顯示了兩個(gè)通道的疊加。

d–f通過(guò)高水平CHAT表達(dá)確認(rèn)的疑核區(qū)域放大。 (e).疑核致密部發(fā)現(xiàn)的非甘氨酸化神經(jīng)元. f.d和e的疊加，揭示CHAT陽(yáng)性神經(jīng)元中沒(méi)有EGFP的表達(dá)。XII舌下神經(jīng)核，IO下橄欖體，10N迷走神經(jīng)背核，AMB 疑核。g.這一版顯示了甘氨酸化神經(jīng)元的形態(tài)。82幅圖像合成的最大密度投影，來(lái)自于雙光子激發(fā)顯微鏡掃描（步長(zhǎng)1um）

Fig. 3 甘氨酸化神經(jīng)元中節(jié)律性鈣離子瞬變。a 通過(guò)雙光子在900nm激發(fā)，以帶有CFP優(yōu)化濾波器(465–495 nm)的CCD檢測(cè)，確認(rèn)GlyT2-EGFP神經(jīng)元（箭頭）b 通過(guò)使用800nm激發(fā)波長(zhǎng)和一個(gè)501–551 nm發(fā)光帶通濾波器顯示和測(cè)量的 OGB-1-AM熒光.所有的GlyT2-EGFP 細(xì)胞 (a) 都被OGB-1-AM (b)標(biāo)記. c 從甘氨酸化神經(jīng)元細(xì)胞記錄的胞內(nèi)自由細(xì)胞溶質(zhì)鈣離子瞬變。跟蹤曲線的條數(shù)相應(yīng)于圖像a和b中神經(jīng)元的個(gè)數(shù)。下面的跟蹤曲線(∫)顯示的是來(lái)自preBötC的積分的群場(chǎng)勢(shì)能。d 實(shí)驗(yàn)的圖像綜合。左軸（白色）顯示吸氣EGFP表達(dá)的甘氨酸化神經(jīng)元（占總甘氨酸化神經(jīng)元）的比例，右軸（黑色）顯示的是吸氣甘氨酸化神經(jīng)元（占總吸氣神經(jīng)元）的比例。數(shù)據(jù)基于5張切片的20幅圖像，以mean±SEM 的形式給出。