Lavision雙光子顯微鏡-毛囊再生過程活體成像

Panteleimon Rompolas1, Elizabeth R. Deschene1*, Giovanni Zito1*, David G. Gonzalez2, Ichiko Saotome1, Ann M. Haberman2& Valentina Greco1

1Department of Genetics, Department of Dermatology, Yale Stem Cell Center, Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.

 2Department of Laboratory Medicine, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.

 

摘要  組織的發(fā)生與再生依賴于細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用和指向干細(xì)胞的信號(hào)以及它們的直接增殖。但是，引導(dǎo)組織適當(dāng)再生的細(xì)胞行為還沒有被很好的理解。運(yùn)用一種新的，非侵入的雙光子成像技術(shù)，我們研究了活鼠隨時(shí)間推移的生理性毛囊再生。通過這種方法，我們監(jiān)測(cè)了真皮層干細(xì)胞和它們的后代在生理性毛囊再生過程中的行為，并指出了間充質(zhì)對(duì)它們行為的影響。承接早先的研究，干細(xì)胞在毛發(fā)再生的初始階段處于靜止?fàn)顟B(tài)而它們的后代處于更活躍的分生狀態(tài)。除了細(xì)胞分化之外，后代細(xì)胞的協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)也允許毛囊的快速擴(kuò)張。最后，我們通過切蝕目標(biāo)細(xì)胞的和長(zhǎng)時(shí)間跟蹤活毛囊展示了間充質(zhì)對(duì)毛發(fā)再生的要求。因此，我們建立了一種直接原位觀察毛囊內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)控的細(xì)胞機(jī)制的方法，這使得我們可以精確調(diào)查生理性再生過程對(duì)毛囊組分的功能性要求。

 

    在原位成像中，對(duì)3周齡的小鼠通過腹膜內(nèi)注射克他命和甲苯噻嗪進(jìn)行麻醉，頭部區(qū)域的皮膚使用機(jī)械剪毛器和脫毛膏剃光。小鼠被放在一個(gè)加熱平臺(tái)上，頭部和耳朵通過一個(gè)自制固定臺(tái)固定。一個(gè)玻璃蓋被放在頭耳結(jié)合部的皮膚上。皮膚的圖像棧通過一臺(tái)裝配Chameleon Vision II (Coherent)雙光子激光器的LaVision TriM II Scope（LaVision Biotech產(chǎn)品）顯微鏡獲取。一束激光(at 940 nm for GFP and 1040 nm for RFP, respectively)通過aX20水浸物鏡（(N.A. 1.0; Olympus)聚焦并以600Hz的頻率掃描0.25到0.5mm2的視野區(qū)域。系列光學(xué)切片在5分鐘內(nèi)以步長(zhǎng)2-3µm成像總深度100µm的組織。從靜止階段向生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變的幾個(gè)相（靜止相到生長(zhǎng)初期相）被分析。在皮膚里使用不同的內(nèi)在標(biāo)記以在不同試驗(yàn)中定位到視野的初始區(qū)域并觀察同一個(gè)毛囊。實(shí)驗(yàn)過程中通過鼻尖吸入氣化異氟醚保持麻醉狀態(tài)。

 

    三維雙光子激光切蝕。使用同樣的光學(xué)設(shè)備進(jìn)行激光切蝕。使用900nm的激光束掃描一個(gè)10µm2的區(qū)域，以25%的激光能量持續(xù)1秒鐘即可獲得切蝕。根據(jù)目標(biāo)深度(30–80 µm)調(diào)整切蝕參數(shù)。

 

Figure 1 | 新的一次生長(zhǎng)開始，細(xì)胞分化是在毛囊中進(jìn)行空間調(diào)控的。a,靜止?fàn)顟B(tài)毛囊。參與毛發(fā)再生的不同細(xì)胞群，包括干細(xì)胞，progeny和間充質(zhì)，存在于定義的毛囊解剖隔層中。 b, 來源于雙光子激光掃描顯微鏡系列光學(xué)切片的靜止態(tài)活毛囊的三維重構(gòu)。上皮細(xì)胞核（綠色）通過角蛋白14啟動(dòng)子(K14H2BGFP)驅(qū)動(dòng)的H2B-GFP融合蛋白顯影。 c, 一個(gè)progeny 分裂的例子。一個(gè)活毛囊的單獨(dú)光學(xué)切片（左側(cè)）和progeny 組分中三個(gè)處于有絲分裂期間細(xì)胞核的放大圖（右側(cè)，插圖）。 d, 從幾個(gè)處于早期生長(zhǎng)階段毛囊(n=17)中定量化細(xì)胞分裂的位置和軸 (生長(zhǎng)初期 II)。e,垂直（左圖）和水平（右圖）方向干細(xì)胞分裂的兩個(gè)例子。一個(gè)活毛囊的單獨(dú)的光學(xué)切片（左側(cè)插圖）和處于有絲分裂中的干細(xì)胞隔層（右側(cè)插圖）的細(xì)胞核放大圖。紅色箭頭，有絲分裂中的親代核與子代核。圖片的時(shí)間推移分別為15分鐘和45分鐘。標(biāo)尺20 µm.

Figure 2 |生長(zhǎng)過程中處于形態(tài)重組的干細(xì)胞progeny隔層. a, 毛囊生長(zhǎng)中的向下伸展。生長(zhǎng)狀態(tài)的活毛囊三個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)（3小時(shí)間隔）的光學(xué)切片，展示了progeny組分向下的伸展（左三） 。核間距增加，干細(xì)胞和progen隔層(大約生長(zhǎng)初期 II to IIIa)中的總細(xì)胞數(shù)被定量。 (右側(cè), 數(shù)據(jù)表示為mean±s.e.m. (n=13–20; asterisk, P< 0.0001) b,毛囊內(nèi)的核重組.兩個(gè)光學(xué)切片（左側(cè)）分別跟蹤和測(cè)量了同一毛囊在0時(shí)刻和4h時(shí)的（右側(cè)）冠面和切面（xy and xz）（大約生長(zhǎng)初期II to IIIa）（底圖）。c, 生長(zhǎng)中毛囊的向下遷移。單一光學(xué)切片表明了單個(gè)毛囊在1小時(shí)間隔連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的完整的（左側(cè)）和下部局部視圖（上側(cè)）。光學(xué)切片中的紅色箭頭和相應(yīng)的跟蹤標(biāo)記了一個(gè)正在向下移動(dòng)的核，5h內(nèi)走過了30µm（大約生長(zhǎng)初期IIIb）。在0h所展示的綠色核的位置以灰色表示用來比較（右下方圖）。標(biāo)尺20µm

Figure 3 | 間充質(zhì)皮膚乳頭的切蝕削弱了毛發(fā)再生的啟動(dòng). a, 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用激光誘導(dǎo)皮膚乳頭細(xì)胞切蝕來測(cè)試間充質(zhì)對(duì)毛發(fā)再生的要求。b, 切蝕皮膚乳頭細(xì)胞的活毛囊四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的高放大率光學(xué)切片。c,包含少數(shù)切蝕皮膚乳頭細(xì)胞的活毛囊的一群毛囊（黃色箭頭）在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的低放大率光學(xué)切片。d,兩個(gè)progeny被部分切蝕的毛囊在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的低放大率光學(xué)切片。e,切蝕皮膚乳頭（上）或部分切蝕progeny隔層（下）的毛囊（作為毛囊的總長(zhǎng)度測(cè)量）生長(zhǎng)與對(duì)照完整毛囊的量化比較。數(shù)據(jù)表示為mean±s.e.m. (n=8–10; asterisk, P< 0.0001).標(biāo)尺50 µm.

Figure 4 | 毛囊再生的細(xì)胞機(jī)制。毛發(fā)再生的初始階段，干細(xì)胞progeny是啟動(dòng)增殖的隔層。雖然分化數(shù)量少于干細(xì)胞progeny，但是隆突內(nèi)部也檢測(cè)到了細(xì)胞的分化。子代隔層是沿毛囊生長(zhǎng)的軸向分化，而隆突內(nèi)的分化方向則是隨機(jī)的。毛囊經(jīng)歷了一個(gè)向下的延伸，其中子代內(nèi)而不是干細(xì)胞隔層內(nèi)的核間距增加。圍繞間充質(zhì)皮膚乳頭的上皮細(xì)胞核重新排列并圍繞間充質(zhì)壓縮。間充質(zhì)的切蝕導(dǎo)致了毛囊生長(zhǎng)的減弱。