人細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A （CagA）檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書

實(shí)驗(yàn)原理
此試劑盒基于酶聯(lián)免疫法，采用HRP酶聯(lián)物；第一次孵育中，樣本中的抗CagA IgG 抗體與包被的CagA 抗原結(jié)合，洗板除去未結(jié)合的，再次孵育，二抗（過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG）與CagA-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，再次洗板后，無(wú)色的顯色劑（TMB）底物液加入微孔內(nèi)，與過(guò)氧化物酶反應(yīng)生成了有顏色的復(fù)合物，加入硫酸終止顏色反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm和405nm處檢測(cè)顏色強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的抗CagA IgG 抗體濃度與顏色強(qiáng)度成正比
 
試劑盒組成
足夠用于96人份的試劑
試劑盒貯存于2-8℃
各試劑有效期見(jiàn)試劑瓶標(biāo)簽
試劑盒一旦開(kāi)封，在2-8℃下可保存2個(gè)月
 

1.        【MTP】包被板，96孔，包被有CagA抗原（重組DNA獲得），未用的板條保存于密封袋內(nèi)2-8℃下

2.        【CAL】標(biāo)準(zhǔn)品，6瓶，1.5ml/瓶，抗CagA IgG 血清基質(zhì)，濃度為0;15;30;60;120;240 RU/ml，即用，紅色，疊氮化鈉（＜0.1%）作為防腐劑

3.        【CONJ】酶聯(lián)物，1瓶，14ml，HRPO標(biāo)記的小鼠單抗抗人IgG，TRIS 緩沖液，穩(wěn)定劑，即用，粉色，新霉素作為防腐劑

4.        【WASH】洗滌緩沖液（濃縮），1瓶，50ml，PBS-吐溫20 ，硫柳汞（＜0.05%）作為防腐劑，使用前，用蒸餾水1:20比例稀釋；若出現(xiàn)不溶解的晶體，則需在37℃下溫育數(shù)分鐘；稀釋的洗滌液可在2-8℃下保存30天

5.        【DIL】樣本稀釋液（濃縮，）1瓶，20ml，血清基質(zhì)，穩(wěn)定劑，紅色，疊氮化鈉（＜0.1%）作為防腐劑，使用前以稀釋的洗滌液1:20比例稀釋；稀釋的樣本稀釋液2-8℃下可保存30天

6.        【TMB】顯色劑，2瓶，15ml，含檸檬酸-磷酸緩沖液，DMSO和H₂O₂的TMB，即用

7.        【STOP】封閉液，1瓶，14ml，1N的硫酸，即用

8.        【CPA】蓋板

9.        塑料包裝袋

1.        帶一次性槍頭的可調(diào)的，自動(dòng)的微量移液器

2.        干燥箱，調(diào)節(jié)至37±2℃

3.        用于試劑稀釋的刻度容器

4.        抽吸式泵或自動(dòng)洗板設(shè)備

5.        酶標(biāo)儀（450nm和405nm）

6.        坐標(biāo)紙

7.        蒸餾水

此實(shí)驗(yàn)還可以用自動(dòng)酶標(biāo)儀進(jìn)行操作
 
樣本采集與準(zhǔn)備
試驗(yàn)可檢測(cè)血清或血漿樣本
適量的脂血樣本不會(huì)影響結(jié)果，高含量的脂血或溶血樣本可能會(huì)影響試驗(yàn)，纖維蛋白絲會(huì)干擾試驗(yàn)；確保檢測(cè)前樣本是清澈的，樣本在2-8℃下可保存1周，想要保存更長(zhǎng)時(shí)間建議凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融
使用前：以1:300的比例用先前已稀釋的樣本稀釋液進(jìn)行樣本稀釋
     （如：10 ul 樣本+ 2990 ul的稀釋液）
 
實(shí)驗(yàn)步驟
試劑和樣本平衡至室溫
使用前來(lái)回倒置混勻樣本

1.        準(zhǔn)備的微孔：空白，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本

2.        加100 ul 的標(biāo)準(zhǔn)品和先前稀釋的樣本于相應(yīng)的微孔內(nèi)

   注意：標(biāo)準(zhǔn)品不用稀釋

1.        空白孔內(nèi)加100 ul 的樣本稀釋液

2.        用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育60±5 min

3.        350 ul的稀釋的洗滌液，洗板4次，吸走微孔內(nèi)的所有液體

4.        每孔加100 ul的酶聯(lián)物

5.        用試劑盒內(nèi)提供的膠粘紙張蓋住包被板，37±2℃下孵育30±2 min

6.        按照步驟5）洗板

7.        每孔加100 ul的顯色劑

8.        37±2℃下孵育15 min，避免直射陽(yáng)光

9.        每孔加100 ul的封閉液

10.     采用合適的酶標(biāo)儀在50nm處讀取吸收值，參考波長(zhǎng)620nm（以空白對(duì)照孔校零），萬(wàn)一出現(xiàn)了吸收值溢出，則選擇在405nm處讀數(shù)；試驗(yàn)操作結(jié)束15min內(nèi)必須完成讀數(shù)

（若采用的是自動(dòng)酶標(biāo)板設(shè)備，依據(jù)相關(guān)手冊(cè)操作）
 
實(shí)驗(yàn)操作圖

1.        樣本IgG 值小于10 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體無(wú)反應(yīng)

2.        樣本IgG 值10 -15 RU/mL，則判定為弱反應(yīng)

3.        樣本IgG 值高于15 RU/mL，則判定為抗CagA IgG 抗體有反應(yīng)

計(jì)算示例
以下數(shù)值僅供演示示例，不能用于代替實(shí)驗(yàn)數(shù)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本抗CagA IgG 抗體滴度為70 RU/mL。
 
驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)
結(jié)果計(jì)算之前，先確保質(zhì)控吸收值在以下期望值范圍內(nèi)

若數(shù)值不在期望值范圍內(nèi)，需重新實(shí)驗(yàn)
 
 
本譯文僅供參考，請(qǐng)以原說(shuō)明書為準(zhǔn)。