重組人胰島素的制備—下游純化工藝的研究

 

摘要　建立了一套通過大腸桿菌表達(H is) 6

2A rg2A rg2人胰島素原[ (H is) 6

2A rg2A rg2human p ro insulin,

RRhP I]制備重組人胰島素的工藝。將大腸桿菌中以包涵體形式表達的RRhP I 依次經(jīng)過DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析, Sephadex G225 層析, 重組復性酶切轉(zhuǎn)化和Superdex75 分子篩, 制備重組人胰島素。SDS2PA GE、HPLC、氨基酸組成分析和小鼠驚厥實驗結(jié)果證明, 制備的重組人胰島素具有天然生物活性, 而且純度較高。

關鍵詞　重組人胰島素　純化　DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑　Superdex75

分離純化是基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán), 這是由于工程菌經(jīng)過大規(guī)模培養(yǎng)后, 產(chǎn)生的有效成分含量很低, 雜質(zhì)含量卻很高; 另外由于基因工程藥物是從轉(zhuǎn)化細胞, 而不是從正常細胞生產(chǎn)的, 因此對產(chǎn)品的純度要求也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。所以要得到合乎醫(yī)用要求的基因工程藥物, 分離純化要比傳統(tǒng)產(chǎn)品困難得多。在重組人胰島素(Recom b inan t hum anin su lin, rh I) 的基因工程生產(chǎn)中, 同樣面臨著下游處理非常復雜的問題。為了能有效地純化目的產(chǎn)物, 目前基因工程生產(chǎn)中普遍使用的是親合層析和HPLC等手段, 這些分離純化技術(shù)雖然分辨率高, 特異性強, 但十分昂貴。不利于降低成本。為了降低生產(chǎn)成本, 本研究建立了一套由(H is) 62A rg2A rg2人胰島素原[ (H is) 62A rg2A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ] 制備重組人胰島素的下游純化工藝, 并對產(chǎn)品的性質(zhì)和純度進行了鑒定。

2. 1　工程菌

　　RRhP Iö pQ E240 大腸桿菌M 15 菌株。

2. 2　主要試劑

DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑, Sephadex, Superdex75, 胰蛋白酶和羧肽酶B, 低分子量蛋白, 人胰島素, 谷胱甘肽(氧化型和還原型),DTT, 其它化學試劑均為國產(chǎn)或進口飛行純。

2. 3　RRhP I 的初步純化

DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析柱用30mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 平衡, 包涵體用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, 50mmo löL DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合適的氯化鈉梯度進行洗脫, SDS2PA GE 確定RRhP I 組分, 收集含RRhP I 的洗脫液。2. 6　復性及酶切轉(zhuǎn)化將初步純化后的RRhP I 在Sephadex G225 層析柱上脫尿素, 轉(zhuǎn)換緩沖液進行重組復性, 然后用胰蛋白酶和羧肽酶B 協(xié)同酶切將RRhP I 轉(zhuǎn)化為人胰島素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo löL ZnCl2 終止反應并沉淀h I。

2. 4　h I 的純化

將h I 粗品用30 mmo löL T ris2HCl, 8 mo löL 尿素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上進行分離純化。層析柱的平衡液和洗脫液均為0. 2 mo löL 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0。

2. 5　HPLC 分析

在HPLC 儀上, 用ODS C18 反相柱(150mm ×6. 0mm ) 進行分析, 流動相為0. 2mo löL(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo löL H3PO 4 調(diào)pH 至3. 5) 和50%乙腈水溶液按1∶1 (vöv ) 混合而成, 流速1. 0m löm in, 檢測波長214 nm , 上樣量20 u l。

2. 10　氨基酸組成分析

稱樣品2. 5 m g, 加6 mo löL HCl 2 m l, 110℃水解24 h, 蒸干后加入2 m l 無離子水溶解, 直接進樣,在氨基酸分析儀上進行氨基酸組成分析。

2. 11　h I 整體生物活性的鑒定

按2000 版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定用小白鼠驚厥法鑒定h I 的整體活性。

3. 1　RRhP I 的初步純化

層析圖譜見圖1, RRhP I 主要集中在峰2。收集峰2, 進行SDS2PA GE 分析, 見圖2。結(jié)果顯示電泳條帶主要集中在13 KD 附近, 峰1 為穿透峰, 此峰中含有p I 高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白質(zhì), 而絕大部分p I 低于RRhP I 的蛋白質(zhì)和核酸類雜質(zhì)牢固地結(jié)合在柱子上, 需要較高的鹽濃度才能洗脫下來。

　　表1 是6 次層析的重復實驗結(jié)果, 可以看出,RRhP I 的回收率較高, 穩(wěn)定在75%～ 80% 左右。

Table 1 　RRhP I recovery of DEAE-Sepharrose Fast Flow ionexchange chromatography

Test number (n= 6)      RRhP I recovery (% )

1                    75. 2

2                    77. 0

3                    75. 5

4                    78. 2

5                    79. 6

6                    79. 8

x±s                   77. 55±1. 81

3. 2　復性及重折疊

經(jīng)過初步純化的RRhP I 通過Sephadex G225柱層析脫尿素并轉(zhuǎn)換緩沖液為50 mmo löL 甘氨酸2N aOH, pH9. 5。層析圖譜(見圖3) , 有2 個層析峰,峰2 主要為折疊趨于正確的單體RRhP I, 收集峰2。進行SDS2PA GE 分析。結(jié)果(見圖2) 顯示, 收集的RRhP I 樣品中高分子量雜蛋白的含量有所減少。峰1 為高分子量雜蛋白和RRhP I 的二聚體或多聚體及折疊不完全或不正確的RRhP I。

3. 3　RRhP I 酶切轉(zhuǎn)化h I

　　在收集的RRhP I 單體組分中, 加入2. 5 mmo löL 還原型谷胱甘肽和0. 25 mmo löL 氧化型谷胱甘肽以控制2SH 比例, 通過二硫鍵的交換形成穩(wěn)定的具有天然結(jié)構(gòu)的RRhP I。在37℃條件下, 用胰蛋白酶(1ö500, 酶öRRhP I 底物) 和羧肽酶B (1ö1000, 酶öRRhP I 底物) 協(xié)同酶切30～ 40 m in, (H is) 62A rg2A rg 和C 肽被準確切除, RRhP I 轉(zhuǎn)化為h I。SDS2PA GE 結(jié)果表明, RRhP I 幾乎被完全酶切轉(zhuǎn)化為h I, 主要電泳條帶的位置從13 KD 附近下移至與人胰島素標準品平行的位置, 見圖2。

3. 4　h I 的純化

用0. 1 mo löL ZnCl2 沉淀的h I 粗產(chǎn)品可通過Superdex 75 進行純層析圖譜見圖4, h I 主要集中在峰3。收集峰3 進行SDS2PA GE 分析, 結(jié)果顯示, 見圖2, 所得h I 組份在SDS2PA GE 分析中是均一的,只有一條蛋白帶。將峰3 組分透析, 濃縮并凍干, 即可最終制得h I。

3. 5　產(chǎn)品的性質(zhì)鑒定

3. 5. 1　SDS2PA GE 分析　結(jié)果(見圖2) 表明, 本研究得到的產(chǎn)品的分子量與h I 標準品相同, 且純度較高, 在SDS2PA GE 中呈一條蛋白帶。3. 5. 2　HPLC 分析　本工藝制備的重組胰島素制品主峰的保留時間(27. 757 m in) 與標準品h I 的保留時間(27. 968 m in) 基本一致, 而與豬胰島素的保留時間(25. 437 m in) 有明顯差別。

圖4　Superdex 75 純化hI

Fig 4　Gel f iltration of hI on Superdex 75Peak a and peak b: impurities, Peak c: h I

3. 5. 3　氨基酸組成分析　分析結(jié)果見表2, 該結(jié)果表明本工藝制備的重組胰島素樣品的氨基酸組成與h I 基本一致。樣品中不含M et, 與胰島素原一起表達的(H is) 62A rg2A rg 已被準確切除, 樣品中只剩下1 個A rg 和2 個H is, 這表明RRhP I 已被成功地轉(zhuǎn)化成了h I。

3. 5. 4　h I 整體生物活性的鑒定　5 只昆明種清潔級小白鼠(雄性20～ 24 g) , 按每20 g 體重皮下注射h I 樣品1. 25 U , 注射后2 h 內(nèi)均出現(xiàn)降血糖陽性反應, 其中有4 只驚厥。隨即腹腔注射1m l 5% 葡萄糖注射液, 驚厥現(xiàn)象消失。這表明本工藝制備的h I 樣品具有很好的降血糖活性。

4. 1　RRhP I 的初步純化

為了快速準確地從大量的雜蛋白中捕獲目標產(chǎn)品, 特異性極高的親和層析是一個理想的選擇。通過專一性識別RRhP I 中的6 個組氨酸殘基, N i2+ 2N TA 親和層析可以一步純化目標產(chǎn)物RRhP I[ 3 ]。但是,N i2+ 2N TA 親和介質(zhì)較昂貴, 勢必增加生產(chǎn)成本, 所以在實際生產(chǎn)中很難推廣應用, 只能用于表達篩選。為了降低成本, 本研究選用相對便宜的DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析初步純化目標產(chǎn)物RRhP I。通過精心篩選層析條件, 目標產(chǎn)物的純化效果較好, SDS2PA GE 分析結(jié)果顯示, 電泳條帶主要集中在MW 13 KD 左右, 收率達77. 5%±1. 81% (n= 6)。目前尚未見采用國產(chǎn)DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析純化重組胰島素產(chǎn)品的相關報道。

4. 2　復性及酶切轉(zhuǎn)換

以包涵體形式表達的RRhP I 由于二硫鍵配對錯誤, 水溶性很差, 在進行DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析時, 為了增加RRhP I 的溶解度, 緩沖液中加入了大量的脲素, 此時RRhP I 處于變性環(huán)境中。因此, 在雙酶切轉(zhuǎn)化之前必須首先除去尿素, 使RRhP I 復性。本研究用Sephadex G225 層析去除變性劑, 可有效防止蛋白的聚集, 并誘導變性蛋白RRhP I 向其天然態(tài)折疊。在我們所采用的條件下進行層析, 得到2 個層析峰, 峰2 為折疊趨于正確的單體RRhP I。其中的高分之量雜蛋白有所減少。峰1為高分子量雜蛋白、多聚RRhP I 及折疊不完全或不正確的RRhP I。對這一部分進行再層析和折疊反應, 可以提高折疊的總收率。由此可見, 此步層析可達到純化, 去除變性劑和誘導復性的三重效果。在體內(nèi), 參與胰島素原轉(zhuǎn)化過程的有兩種Ca2+依賴的內(nèi)肽酶以及羧肽酶H。在體外, 用胰蛋白酶和羧肽酶B 協(xié)同酶切同樣可將胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素[ 4, 5 ] , 這使得通過E. co li 表達人胰島素原制備人胰島素成為可能。在本研究構(gòu)建的表達產(chǎn)物中, 引導肽(H is) 6 與胰島素原之間插入了兩個A rg, 這與C肽和胰島素之間連接的方式是相同的, 因此在雙酶切轉(zhuǎn)化的同時, (H is) 62A rg2A rg 可以被準確去掉,不必另外采用其它的處理方式, 從而減化了后處理過程。在本研究所選用的酶切條件下, RRhP I 被準確有效地轉(zhuǎn)變成了h I。SDS2PA GE 分析顯示, 酶切較完全, 主要電泳條帶從13 KD 附近轉(zhuǎn)移到了與人胰島素標準品平行的位置。

4. 3　胰島素純化

目前人們普遍使用制備型HPLC 進行基因工程產(chǎn)物的最后一步純化[ 6～ 8 ]。這是因為HPLC 具有操作方便快捷, 分辨率高, 產(chǎn)品純度能一次性達到臨床要求等優(yōu)點。但是HPLC 具有對軟硬件的要求較高, 前期投入大, 純化量有限等等缺點, 從而使生產(chǎn)能力受到影響。本研究在最后純化制備人胰島素時選用的Superdex 75 分子篩層析, 其具有機械強度高, 穩(wěn)定性好, 重現(xiàn)性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨率高(13 000 p latesöm ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m löm in, 25℃) , 且可在低壓下操作, pH 范圍廣(3～12) , 分離范圍廣(球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特異性吸附小, 負載量大, 層析條件易控制等等優(yōu)點, 是一個非常理想的純化基因工程產(chǎn)品的層析方法。用0.2 mo löL 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0 的緩沖液作平衡液和

洗脫液, 將h I 粗品經(jīng)過Superdex 75 柱層析后, 我們得到了純度較高的人胰島素制品, SDS2PA GE 分析樣品只有一條帶。目前尚未見采用Superdex 75純化基因工程產(chǎn)品的有關報道。胰島素是天然生物活性物質(zhì), 必須保持天然的二級結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮降血糖的生物活性。小鼠驚厥實驗的陽性結(jié)果充分表明, 本研究所選擇的層析條件不但有效地純化了表達產(chǎn)物, 而且有效地防止了目標產(chǎn)物h I 的失活變性, 本研究最終制備了純度較高的具有天然活性的基因工程人胰島素。