1 ,6-二磷酸果糖對熱性驚厥大鼠學習記憶和情感行為損害保護作用的研究

1 ,6-二磷酸果糖對熱性驚厥大鼠學習記憶和情感行為損害保護作用的研究

摘　要: 　

【目的】　探討1 ,6-二磷酸果糖(f ructose21 ,62diphosphate ,FDP) 對大鼠熱性驚厥性學習記憶和情感行為損

害的保護作用。　

【方法】　30 只21 日齡雄性SD 大鼠隨機均分為果糖干預( FDP intervention group ,FD) 、鹽水對照( so-dium chloride solutin cont rol group ,NS) 和熱性驚厥組(febrile seizure group ,FS) 。水浴法建立熱性驚厥模型; FD 組于驚厥前30min 腹腔注射FDP25mg/ 100g 大鼠體重;而NS 組腹腔注射相同體積的0. 9 %氯化鈉溶液; FS 組不予干預。觀察各組在避暗試驗(passive avoidance test , PAT) 、Morris 水迷宮(Morris water maze ,MWM) 及曠場試驗(open field test ,OFT) 中學習記憶和情感行為的變化�！�

【結果】　FDP 可使驚厥大鼠在PAT 中的記憶潛伏期延長[ FD 組為(341. 16 ±97. 44) s ,NS 組為(227. 62 ±92. 19) s ,FS 組為(213. 66 ±90. 70) s , P < 0. 01 ] ,錯誤次數(shù)減少( FD 組為1. 84 ±1. 27 ,NS 組為4. 97 ±1. 18 ,FS 組為5. 06 ±1. 38 , P < 0. 01) ;在OFT 中,FDP 可增強反復驚厥大鼠的興奮性( FD 組得分為65. 41 ±8. 02 ,NS組為46. 22 ±7. 97 , FS組為48. 81 ±7. 69 , P < 0 . 01) ,提高大鼠對陌生環(huán)境的適應能力( FD組后肢性站立的次數(shù)為36. 29 ±5. 06 ,NS組為18. 72 ±4. 71 ,FS組為20. 06 ±4. 96 , P < 0. 01) ,改善大鼠的緊張情緒( FD組糞便粒數(shù)為5. 62 ±2. 76 ,NS 組為10. 79 ±2. 91 ,FS 組為11. 43 ±3. 01 , P < 0. 01) ;在MWM 中,FD 組大鼠逃逸潛伏期縮短,搜尋策略改善。　

【結論】　1 ,6-二磷酸果糖可以改善反復驚厥大鼠的學習記憶和情感行為,對驚厥性腦功能損傷具有保護作用。

關鍵詞: 　1 ,6-二磷酸果糖( FDP) ; 熱性驚厥; 學習記憶; 行為; Morris 水迷宮

　　熱性驚厥(febrile seizures ,FS) 是兒科常見急癥,有導致不同程度腦損傷的潛在危險。動物實驗證實反復熱性驚厥可導致大鼠學習記憶功能異常和神經(jīng)元、細胞器及突觸病理結構變化[1～2 ] 。作者采用腹腔預注射1 ,6-二磷酸果糖(f ruc-tose21 ,6-diphosphate ,FDP) 對反復熱性驚厥的幼鼠進行干預,探討FDP 對大鼠熱性驚厥性學習記憶和情感行為損害是否具有保護作用。

1 　對象和方法

1. 1 　對象21日齡雄性SD 大鼠30 只(西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供) ,體質量為(50 ±5) g ;按隨機數(shù)字法均分為果糖干預組( FDP intervention group ,FD) 、鹽水對照組(sodium chloride solution cont rol ,NS) 和熱性驚厥組( FS) ,每組大鼠數(shù)目均為10 只;各組均于標準環(huán)境下飼養(yǎng),自由進食飲水。

1. 2 　方法　

1. 2. 1 　模型建立　采用改良熱水浴法[1 ]建立熱性驚厥大鼠模型。FD 組大鼠每次誘發(fā)熱性驚厥前30 min ,按25 mg/100 g ( 即1ml / 10 0 g) 大鼠體重的劑量向大鼠腹腔內注射2. 5 %的FDP 溶液( FDP 由海南天王國際制藥有限公司提供,批號:20050114) ;而NS 組大鼠腹腔注射相同體積(1 ml/100 g 大鼠體重) 的0. 9 %氯化鈉溶液; FS 組不給予任何干預措施。

1. 2. 2 　避暗試驗(passive avoidance test ,PAT) 　SFK- Ⅰ型避暗測試箱(日本產(chǎn)) 分明、暗兩室,其間有小門相通;避暗習性使大鼠本能地選擇進入暗室,進入暗室的大鼠即刻遭受電擊(3 mA ,50 Hz) 而被動地逃回安全的明室。5 min 不進入暗室則被認為完成了學習,記錄大鼠在完成學習前錯誤地進入暗室的次數(shù),主要反映大鼠近期學習的能力;24 h 后再次放回明室,記錄大鼠由明室進入暗室的時間,即為記憶潛伏期,主要反映大鼠近期記憶的能力。

1. 2. 3 　曠場試驗(open field test ,OFT) 　60 cm ×60 cm ×60 cm 的無頂木盒底部等分為36 個小方格,大鼠放置于中央方格,記錄5 min 內大鼠活動經(jīng)過的格子數(shù)、后肢性站立的次數(shù)以及排出糞便的粒數(shù)。記分標準為:大鼠1/ 2 以上身體進入相鄰方格記1 分,后肢性站立記1 分,合計為其總分。研究認為,經(jīng)過的格子數(shù)反映動物的興奮性;后肢性站立的次數(shù)代表大鼠對陌生環(huán)境的適應能力;排出糞便的粒數(shù)提示大鼠的緊張程度[3 ] 。

1. 2. 4 　Morris 水迷宮(Morris water maze ,MWM) 試驗Morris水迷宮由圓形水池(直徑130 cm ,高50 cm) 、攝像頭以及操作分析系統(tǒng)組成。圓形水面被通過圓心的兩條假想垂線劃分為4 個象限。試驗前一天使大鼠在水池內自由游泳2 min ,以熟悉環(huán)境。試驗共4. 5 d ,在一個象限的正中水域內放置一個圓形透明站臺(直徑10 cm ,高28 cm) ,站臺隱于水面下2 cm 處,水溫保持于24 ℃左右。每天上、下午各進行4 次試驗,每只大鼠隨機從每個象限的中點面壁式入水1 次,大鼠入水后盡力逃避水患,當發(fā)現(xiàn)站臺后則棲身其上,圖象采集系統(tǒng)自動記錄大鼠找到站臺的潛伏期。如果120秒仍未找到站臺,由操作者將大鼠引上站臺休息4 秒并將潛伏期記為120 秒。每只大鼠上、下午4 次成績的均值作為一個時段值( Ⅰ2 Ⅸ) 進行分析。大鼠搜尋站臺的策略分為直線式、趨向式、隨機式和邊緣式[1 ] 。從搜尋站臺的效率來看,四種策略的優(yōu)劣次序依次為直線式、趨向式、隨機式、邊緣式。

1. 3 　統(tǒng)計學處理　計量資料以均數(shù)±標準差( . x ±s) 表示。采用SPSS 10. 0 統(tǒng)計軟件依資料性質分別進行方差分析及q 檢驗、χ2 檢驗,MWM 試驗應用自帶軟件進行方差分析,檢驗水準為α= 0. 05 。

2 　結　果

2. 1 　PAT 中學習記憶的變化　FD 組大鼠在達到學會程度時錯誤次數(shù)最少,同NS、FS 組有顯著性差異( q = 6. 63 ,6.29 ; P < 0. 01) 。24 h 后FD 組大鼠的記憶潛伏期最長,同NS、FS 組差異有顯著性( q = 5. 76 ,6. 03 ; P < 0. 01) 。表明FDP 對反復熱性驚厥導致的近期學習記憶受損有保護作用。見表1 。

2. 2 　OFT 中情感行為的改變　FD 組大鼠穿格得分分值最高,后肢性站立的次數(shù)最多,5 min 內排出的糞便粒數(shù)最少;FD 組同NS、FS 組在穿格得分( q = 4. 89 ,4. 63 ; P < 0. 01) 、后肢性站立的次數(shù)( q = 5. 38 ,5. 07 ; P < 0. 01) 以及排出糞便粒數(shù)( q = 5. 81 ,5. 64 ; P < 0. 01) 等方面的差異有顯著性,提示FDP 可以改善反復驚厥導致的大鼠情感行為異常。見表1 。

2. 3 　MWM 試驗中空間學習能力的變化　FD 組大鼠在Morris 水迷宮中尋找隱匿站臺的能力提高,表現(xiàn)為逃逸潛伏期顯著縮短,方差分析表明FD 組同NS、FS 組在逃逸潛伏期方面存在顯著的統(tǒng)計學差異( F = 133. 19 , P < 0. 01) 。見圖1 。

　　FD 組大鼠在Morris 水迷宮試驗中以直線式策略搜尋站臺的頻數(shù)和百分比最高,而以邊緣式策略搜尋站臺的頻數(shù)和百分比最低,說明FD 組搜尋站臺的效率最高。χ2 檢驗表明FD 組同其他兩組在搜尋策略方面存在顯著的統(tǒng)計學差異(χ2 = 50. 51 , P < 0. 005) ; FD 組同F(xiàn)S 組(χ2 = 40. 50 , P <0. 005) 及NS 組(χ2 = 42. 72 , P < 0. 005) 比較也存在顯著的統(tǒng)計學差異,以上結果提示FDP 可以改善反復驚厥導致的大鼠空間學習記憶能力損害。見表2 。

3 　討　論

多項長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)FS 和日后情感行為異常、學習困難、智能發(fā)育落后以及顳葉癲癇等有一定的聯(lián)系[4 ,5 ] 。動物實驗證實反復FS 可導致未成熟腦的功能[1 ] (學習記憶和情感行為) 和形態(tài)結構[2 ] (神經(jīng)元、細胞器) 出現(xiàn)不同程度損傷。FS 腦損傷干預措施的研究已受到關注。本實驗預注射FDP 對反復熱性驚厥的幼鼠進行干預發(fā)現(xiàn), FDP 改善了反復驚厥大鼠的學習記憶和情感行為,提示FDP 對FS 腦功能損傷具有保護作用。

3. 1 　FDP 的臨床應用與作用機制　FDP 是葡萄糖代謝中的一種重要的中間產(chǎn)物,可激活糖酵解中限速酶- 磷酸果糖激酶及丙酮酸激酶活性,加速磷酸烯酮式丙酮酸向丙酮酸轉化,增加細胞內能量,FDP 與細胞膜相互作用改變膜離子通透性,能有效防止平滑肌細胞、神經(jīng)元、血小板、神經(jīng)細胞、心肌細胞的“鈣超載”,提高激活Na + 2K+ 泵的活性,防止細胞水腫[6 ] ,具有膜穩(wěn)定、細胞保護、抗氧化及改善氧代謝等作用。FDP 在臨床上已廣泛應用于心肌受損性疾病輔助治療,此外還應用于肝、腎、腦血管等疾病治療和研究[7 ,8 ] 。FDP 的神經(jīng)保護作用機制主要有[9～11 ] : ①FDP 作為一種高能物質及糖酵解的調節(jié)劑,參與細胞代謝提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量; ②提高離子泵能量,抑制Ca2 + 內流,穩(wěn)定細胞內Ca2 + ,維持內環(huán)境穩(wěn)定; ③促進糖無氧酵解,抑制有氧氧化,從而減少氧自由基和有害氨基酸的產(chǎn)生; ④提高紅細胞內2 ,32二磷酸甘油酸含量,穩(wěn)定紅細胞膜,增加缺氧組織對氧的利用。此外, FDP 減少缺氧后大腦早期基因蛋白mRNA 的表達,抑制凋亡和神經(jīng)元壞死[12 ] ; FDP 還具有改善和調節(jié)細胞的信號通路[13 ]的作用。

3. 2 　FDP 對驚厥性腦損傷的保護作用　反復多次熱性驚厥發(fā)生時,大腦處于缺氧及相對性缺血狀態(tài),對缺氧缺血敏感的海馬部位表現(xiàn)更為明顯。頻繁驚厥所致的缺氧可使線粒體發(fā)生病理變化,出現(xiàn)腫脹甚至空泡樣變,細胞產(chǎn)生ATP不足,致使維持細胞內外離子平衡的各種通道功能受損,尤其是ATP 依賴性的Ca2 + 通道受累,Ca2 + 外流作用受阻而出現(xiàn)反向內流,Ca2 + 內流造成的鈣負載以及由此而激發(fā)的各種興奮性氨基酸及自由基的大量釋放,最終導致神經(jīng)元變性壞死;興奮性神經(jīng)遞質應激狀態(tài)下的大量釋放以及缺氧狀態(tài)下神經(jīng)突觸聯(lián)系功能的減弱,使神經(jīng)元異常興奮放電增強,又可以促發(fā)驚厥的發(fā)生,形成惡性循環(huán)[2 ] 。FDP 是重要的能源物質,可以通過各種生物膜和血腦屏障而到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織和細胞,提供離子泵活動以及神經(jīng)元代謝所需的能量,保證正常狀態(tài)下Ca2 + 的外流,阻止Ca2 + 反向內流;促進攜氧紅細胞在缺氧組織釋放氧,增加缺氧局部的氧含量,緩解細胞缺氧狀態(tài);增強紅細胞內二磷酸甘油酸含量,抑制氧自由基和組織胺釋放的作用。推測以上機制的綜合參與使驚厥性神經(jīng)細胞損傷減輕,學習記憶等腦功能改善。