冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠覺(jué)醒能力及認(rèn)知功能的影響

摘要 目的: 探討冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能損害的干預(yù)作用。方法: 首先采取跑臺(tái)作業(yè)方法建立大鼠長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)模型, 將模型大鼠分為跑臺(tái)冰片組和跑臺(tái)對(duì)照組, 另設(shè)未跑臺(tái)對(duì)照組。隨后觀察冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠活動(dòng)- 靜止行為、 覺(jué)醒時(shí)間以及穿梭箱主動(dòng)回避反應(yīng)的影響。 結(jié)果: 3 組納入測(cè)試的大鼠各為 6 只。 結(jié)果顯示給予 0.4 g /kg 冰片(經(jīng)胃灌飼)可增加大鼠長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)后的自主活動(dòng)量(每分鐘活動(dòng)次數(shù)未跑臺(tái)對(duì)照組為 54.1± 5.4, 跑臺(tái)對(duì)照組為 15.5± 8.3, 跑臺(tái)冰片組為 26.8± 7.8, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05)和覺(jué)醒時(shí)間(未跑臺(tái)對(duì)照組為 639 min± 46 min, 跑臺(tái)對(duì)照組為 411 min± 36 min,跑臺(tái)冰片組為 501 min± 52 min, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05) , 同時(shí)還可改善長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠的認(rèn)知功能(穿梭箱主動(dòng)回避作為測(cè)試反應(yīng)時(shí)間, 未跑臺(tái)對(duì)照組為 5.63 s± 1.01 s, 跑臺(tái)對(duì)照組為 6.85 s± 1.24 s, 跑臺(tái)冰片組為 6.26 s± 0.96 s, 3 組之間兩兩比較, P 均<0.05)。結(jié)論: 冰片可在一定程度上逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)對(duì)大鼠覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能的損害作用。

關(guān)鍵詞 冰片;大鼠長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè);覺(jué)醒能力;認(rèn)知功能

長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)對(duì)覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能有顯著的損害作用。當(dāng)前，這一問(wèn)題的研究已逐漸引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視 [ 1,2]。迄今已研發(fā)和篩選出多種抗疲勞藥物及神經(jīng)興奮劑，包括咖啡茵、可可堿、苯丙胺（安非他明）和莫達(dá)非尼等。盡管這些藥物早已得到應(yīng)用，但其成癮性和選擇性差等缺點(diǎn)在很大程度上限制了其廣泛使用。因此，尋找速效、后效應(yīng)小以及成癮性小、高選擇性的精神興奮劑必然會(huì)成為今后研究的重點(diǎn)[ 3,4]。中醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)，在篩選理想的精神興奮藥物方面有著廣闊的前景，例如牛黃、冰片、麝香、石菖蒲以及蘇合香等芳香開(kāi)竅藥在臨床實(shí)踐中已有大量的應(yīng)用[ 5,6]。冰片（又稱龍腦）為常用芳香開(kāi)竅中藥之一，系龍腦香科植物龍腦香樹(shù)脂的加工品，或樟腦、松節(jié)油等經(jīng)化學(xué)合成加工制成品。天然冰片主要化學(xué)成分為龍腦，尚含有大量龍腦的差向異構(gòu)體異龍腦。中醫(yī)認(rèn)為冰片味辛苦、微寒、歸心、脾、肺經(jīng)，有開(kāi)竅醒神、通諸竅等作用。對(duì)冰片的藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及安全性等方面的研究表明，冰片除具有抗炎、抗菌、抗生育以及止痛等作用外，還可以縮短戊巴比妥鈉持續(xù)睡眠時(shí)間，表現(xiàn)出醒腦和興奮作用[ 7]；而且冰片還能延長(zhǎng)小鼠耐缺氧存活時(shí)間[ 8]。另外，含有冰片的一些方劑，如安宮牛黃丸和復(fù)方丹參片等，已廣泛用于神經(jīng)內(nèi)科，對(duì)于治療昏迷、改善老年性癡呆患者的認(rèn)知功能有明顯療效[ 9～11]。綜上所述，我們有理由推測(cè)，冰片可能具有改善長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)工作狀態(tài)，以實(shí)現(xiàn)提升覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能的作用。為了探明冰片是否具有逆轉(zhuǎn)或防治長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)不利因素的作用，我們建立了長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠模型，觀察連續(xù)作業(yè)結(jié)束后給予冰片對(duì)大鼠隨后 12 h 覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

戊巴比妥，天然冰片，液體石蠟；實(shí)驗(yàn)前取適量冰片結(jié)晶體，研缽研細(xì)，用液體石蠟配成 8%冰片石蠟油混懸液。分析天平，立體定向儀，多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，小動(dòng)物跑臺(tái)，穿梭箱主動(dòng)回避行為測(cè)試裝置，視頻監(jiān)視器，視頻捕捉及分析軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重( 250±10)g。所有大鼠均在設(shè)定的室內(nèi)環(huán)境中至少適應(yīng) 2周。室內(nèi)環(huán)境：明-暗周期 12 h: 12 h（7: 00 開(kāi)始給予光照），自然光照，溫度 24~26 ℃。動(dòng)物自由飲水、攝食。實(shí)驗(yàn)共分為 3 組，各組 6 只大鼠：①未跑臺(tái)對(duì)照組：不進(jìn)行跑臺(tái)作業(yè)，置于鼠籠中自由活動(dòng)，進(jìn)食、飲水時(shí)間及其他處理因素與作業(yè)組一致；②跑臺(tái)冰片組：進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)連續(xù)跑臺(tái)作業(yè)，作業(yè)結(jié)束后給予 0. 4 g/ kg冰片石蠟油溶液；③跑臺(tái)石蠟油組：在進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)連續(xù)跑臺(tái)作業(yè)結(jié)束后給予與跑臺(tái)冰片組同體積的石蠟油溶液。

1.3 腦電電極安放及皮層腦電( electrocorticogram,ECOG)記錄具體方法參照以往文獻(xiàn)[ 12]進(jìn)行。戊巴比妥鈉麻醉（30 m g/ kg，腹腔注射）后，大鼠頭部固定于立體定向儀框架上。將銅質(zhì)螺絲釘分別通過(guò)顱骨埋入額葉和頂葉皮層，以接觸到硬腦膜為度，用于記錄皮層腦電活動(dòng)。腦電極以牙科水泥固定于顱骨上。手術(shù)結(jié)束后，動(dòng)物在上述室內(nèi)環(huán)境中恢復(fù) 2 周。采用 R M 6240 多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)進(jìn)行腦電記錄。

1.4 長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)方法

長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)在小動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行，采用我們已建立的（18+6 h）×2 作業(yè)模式[ 12]。作業(yè)過(guò)程包括 20 m i n 作業(yè) +20 m i n 作業(yè)暫停，作業(yè)和作業(yè)暫停視為 1 個(gè)周期。跑臺(tái)參數(shù)設(shè)定：作業(yè)時(shí)坡度0°，速度 15 m / m i n；作業(yè)暫停時(shí)坡度 0°，速度 7m / m i n。作業(yè)暫停過(guò)程中，跑臺(tái)速度較為緩慢，由于跑道長(zhǎng)約 1 m ，則動(dòng)物每次最多可有 9 s的運(yùn)動(dòng)暫停時(shí)間，此時(shí)運(yùn)動(dòng)因素影響作用降到最低，而只是達(dá)到睡眠剝奪的目的，因此我們把此過(guò)程稱為作業(yè)暫停。整個(gè)過(guò)程連續(xù)給予電刺激，刺激強(qiáng)度20 V，頻率 60 H z，一旦動(dòng)物進(jìn)入電刺激區(qū)則會(huì)受到電擊，迫使其繼續(xù)運(yùn)動(dòng)。每 4 個(gè)周期后將動(dòng)物置于籠中給予自由活動(dòng)，自由攝食、飲水 15m i n。作業(yè)前所有動(dòng)物均未進(jìn)行過(guò)跑臺(tái)適應(yīng)訓(xùn)練。本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù) 48 h（兩個(gè)晝夜周期）作業(yè)模式，每個(gè)晝夜周期包括作業(yè)階段和休息階段兩個(gè)部分。（1）跑臺(tái)作業(yè)階段： 第 1 天19: 00至第 2 天13: 00，進(jìn)行跑臺(tái)作業(yè)訓(xùn)練；（2）休息階段：第 2 天13: 00～ 19: 00，大鼠在鼠籠中自由活動(dòng)，自由攝食、飲水。

1.5 給藥方法

參照文獻(xiàn)劑量[ 9]， 冰片所用劑量為 0. 4 g /kg，通過(guò)自制的灌胃管給藥。給藥均在跑臺(tái)作業(yè)結(jié)束（13: 00） 后 5. 5 h （18: 30）進(jìn)行，在 30 m i n內(nèi)完成。

1.6 覺(jué)醒能力及認(rèn)知功能評(píng)價(jià)

通過(guò) 3 項(xiàng)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能，即大鼠覺(jué)醒期間（19: 00～ 7: 00）的行為狀態(tài)分布模式、覺(jué)醒時(shí)間以及穿梭箱主動(dòng)回避行為測(cè)試。

1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

計(jì)量資料以 x± s 表示，采用 SPSS10. 0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（A N O V A） 。

2 結(jié)果

2.1 冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠活動(dòng)- 靜止行為活動(dòng)分布的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)視頻監(jiān)視器對(duì)大鼠自主活動(dòng)進(jìn)行連續(xù)觀察和記錄，記錄結(jié)果通過(guò)視頻分析系統(tǒng)（R M V I D EO）進(jìn)行分析，該系統(tǒng)把大鼠自主活動(dòng)簡(jiǎn)化為活動(dòng)和靜止兩種狀態(tài)，自主活動(dòng)量以平均每分鐘的活動(dòng)次數(shù)計(jì)算。結(jié)果如表 1 所示，未跑臺(tái)對(duì)照組在整個(gè)夜間（19: 00- 7: 00）主要處于活動(dòng)狀態(tài)；跑臺(tái)冰片組活動(dòng)明顯多于跑臺(tái)石蠟油組（P<0. 05） ，但仍比未跑臺(tái)對(duì)照組少（P <0. 01）2.2 冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠覺(jué)醒時(shí)間的影響動(dòng)物的睡眠、覺(jué)醒狀態(tài)主要通過(guò) EC O G 進(jìn)行判斷： δ波（0. 25～ 4 H z）通�？勺鳛槁�波睡眠的判定指標(biāo)[13]。覺(jué)醒時(shí)間測(cè)試結(jié)果：未跑臺(tái)對(duì)照組為（639± 46）m i n，跑臺(tái)石蠟油組為（411± 36）m i n，跑臺(tái)冰片組為（501± 52）m i n；3 組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 05） 。

2.3 冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠穿梭箱主動(dòng)回避反應(yīng)的影響給藥后 3 組大鼠分別進(jìn)行穿梭箱主動(dòng)回避行為測(cè)試，測(cè)試均在 21: 00 進(jìn)行。各組大鼠反應(yīng)時(shí)間：未跑臺(tái)對(duì)照組為（5. 63 ± 1. 01）s， 跑臺(tái)石蠟組為（6. 85 ±1. 24）s，跑臺(tái)冰片組為（6. 26 ±0. 96）s；3 組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P <0. 05） 。

3 討論

長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)對(duì)機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)以及各種正常功能產(chǎn)生復(fù)雜影響，主要表現(xiàn)為覺(jué)醒能力的下降（即覺(jué)醒不良，ar ousaldef i ci t）和認(rèn)知功能的受損[13～ 16]，即工作狀態(tài)受損。因此，目前對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)不利影響防護(hù)措施的研究主要是集中于探索改善覺(jué)醒狀態(tài)與恢復(fù)認(rèn)知功能。大量文獻(xiàn)已經(jīng)表明，目前作業(yè)過(guò)程中作業(yè)能力下降的防治措施主要包括兩方面：非藥物干預(yù)和藥物干預(yù)[2～5]。中醫(yī)認(rèn)為芳香開(kāi)竅藥（如牛黃、冰片、麝香、石菖蒲以及蘇合香等）具有通關(guān)開(kāi)竅、啟閉醒神的作用，用于治療閉證�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，某些芳香開(kāi)竅藥具有興奮神經(jīng)系統(tǒng)，改善工作狀態(tài)以及減少睡眠等作用[6～11]。例如，小劑量麝香可縮短異戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠時(shí)間；麝香水劑給清醒兔靜脈注射，首先引起大腦皮層興奮，表現(xiàn)為腦電去同步化，隨后腦電出現(xiàn)高壓復(fù)合波群，但行為上一直保持警惕狀態(tài)，毫無(wú)困倦和睡眠傾向，并未出現(xiàn)痙攣、抽搐[17, 18]。又如，安宮牛黃丸可以廣泛促進(jìn) c- f os基因在腦干、丘腦以及皮層相關(guān)覺(jué)醒腦區(qū)的表達(dá)，提示該藥可能通過(guò)激活這些腦區(qū)從而達(dá)到促進(jìn)清醒的作用[19]。文獻(xiàn)中對(duì)單味冰片的醒腦和興奮作用已有報(bào)道[9]。在此基礎(chǔ)上，我們觀察了冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠覺(jué)醒能力及認(rèn)知功能的影響。實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過(guò)跑臺(tái)作業(yè)方式建立連續(xù)作業(yè)大鼠模型，在作業(yè)過(guò)程結(jié)束后灌胃給予適量冰片，結(jié)果顯示，冰片在一定程度上可以恢復(fù)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠的活動(dòng)能力，增加覺(jué)醒時(shí)間，同時(shí)對(duì)認(rèn)知功能也有改善作用。需要說(shuō)明的是，本實(shí)驗(yàn)中的冰片給藥劑量（0. 4 g/ kg）依據(jù)了既往報(bào)道[9]，該文獻(xiàn)中所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠，而本實(shí)驗(yàn)中采用的是大鼠，但二者的結(jié)論是一致的，即冰片在該劑量下具有明顯的促覺(jué)醒效應(yīng)。另一方面，有文獻(xiàn)證實(shí)，冰片可以改變下丘腦去甲腎上腺素、多巴胺、組胺以及 5- 羥色胺的含量[20]，而下丘腦的這些遞質(zhì)又與機(jī)體覺(jué)醒狀態(tài)的發(fā)生和維持密切相關(guān)，因此我們推測(cè)，冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)大鼠覺(jué)醒能力和認(rèn)知功能的影響可能涉及上述遞質(zhì)水平的變化。這一推測(cè)是否成立還需要實(shí)驗(yàn)證明。盡管我們的研究初步揭示了冰片對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)的不利影響可起到一定的干預(yù)作用，但其作用機(jī)理以及冰片的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和副反應(yīng)等問(wèn)題還需要更多的實(shí)驗(yàn)探明。此外，其他芳香開(kāi)竅藥是否同樣可以對(duì)長(zhǎng)時(shí)連續(xù)作業(yè)所引起的不利影響產(chǎn)生干預(yù)作用，亦有待進(jìn)一步研究。