和血益智方對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬的影響

 

〔 摘要〕目的  觀察和血益智方對VD大鼠行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的影響。

方法  動物隨機分為假手術(shù)組和模型組。VD模型制作成功后隨機分為和血益智方小劑量組和大劑量組、思爾明組、生理鹽水（NS）組。用穿梭箱和水迷宮檢測大鼠行為學(xué)并作海馬 常規(guī)染色，光鏡觀察。 和血益智方、思爾明均能縮短VD大鼠穿梭箱實驗主動逃避時間和遭受電擊時間，減少遭受電擊次數(shù)；能縮短VD大鼠水迷宮實驗時定位航行潛伏期、游泳的路徑，增加大鼠空間探索實驗中穿越原目標(biāo)的次數(shù)。NS組海馬細胞體積變大、核變小、有核仁消失和核固縮；除假手術(shù)組正常外，其余各組海馬細胞層次有減少，但細胞排列比較密集、細胞形態(tài)尚可。

結(jié)論  和血益智方可改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

〔關(guān)鍵詞〕血管性癡呆；MORRIS水迷宮；學(xué)習(xí)記憶；海馬

血管性癡呆（vascular dementia,VD）是老年人多發(fā)癡呆之一，系繼發(fā)于腦血管病變后的緩慢性、漸進性智能障礙。它不僅給患者帶來軀體上的痛苦，也帶來精神上的巨大負(fù)擔(dān)。中醫(yī)學(xué)院名老中醫(yī)教授用和血益智方治療VD有較好的臨床療效。本實驗從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)方面研究了和血益智方抗大鼠VD的作用，現(xiàn)報道如下。

1材料和方法

1.1動物及分組

經(jīng)穿梭箱實驗篩選的健康正常SD大鼠，體重220~250 g 10，雄性，隨機分為假手術(shù)組（10只）和模型組。將造模成功的VD大鼠40只隨機分為HXYZ組1（和血益智方小劑量）、HXYZ組2（和血益智方大劑量）、思爾明（Sermion）組、生理鹽水（NS）組，每組各10只。各組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2試劑及器材

Sermion、染發(fā)劑

和血益智方含當(dāng)歸、川芎、白芍、生地、黃芪、旱蓮草、女貞子、益智仁等。所有藥材一次性水煎濃縮為水煎液，用無菌玻璃瓶分裝、密封，經(jīng)Co60照射后 4℃ 保存。給藥前在40℃ 恒溫水溫箱中加熱備用。

Morris水迷宮、穿梭箱實驗系統(tǒng)、電熱恒溫水溫箱。切片機、顯微鏡、顯微攝像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 模型制作及給藥

VD模型制作及術(shù)后處理按參考文獻[1]進行，夾閉大鼠雙側(cè)的頸總動脈5 min、后復(fù)灌1 h、連續(xù)3次、末次灌注后永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造模型。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈，既不夾閉也不結(jié)扎雙側(cè)的頸總動脈，其他與模型組相同。

動物造模成功后，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后開始給藥：HXYZ組1、假手術(shù)組大鼠給予125%

和血益智方水煎劑，Sermion組給予0.5 mg/100g思爾明混懸液、NS組給予生理鹽水，以上各組均按1 mL/100g灌胃；HXYZ組2用125% 2 mL/100g和血益智方灌胃；各組動物均用藥30d。

1.3.2行為學(xué)檢測

從用藥第26天起，分別進行大鼠穿梭箱實驗和Morris水迷宮實驗。

1.3.2.11

穿梭箱實驗 大鼠穿梭箱實驗每日1次，連續(xù)5 d ，共5次；每次穿梭箱實驗于當(dāng)天晚6時進行，方法參考文獻[1]。

1.3.2.2水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗每天2次，連續(xù)5d，內(nèi)容包括學(xué)習(xí)訓(xùn)練、定位航行（游泳時間設(shè)定為120s）、空間探索實驗（游泳時間設(shè)定為30 s），具體操作方法同參考文獻[1]。水迷宮實驗于每天白天進行。每次大鼠穿梭箱實驗和Morris水迷宮實驗各組別順序相同。

1.3.3病理學(xué)觀察

行為學(xué)檢測完畢，立即斷頭處死大鼠，取左側(cè)海馬甲醛固定，然后作HE常規(guī)染色，光鏡觀察。

1.4統(tǒng)計方法

各組穿梭箱實驗電擊次數(shù)、電擊時間、主動回避時間和水迷宮實驗潛伏期、穿越目標(biāo)次數(shù)、路徑等指標(biāo)用SPSS 10.0軟件進行AVON（單因素方差分析）檢驗。根據(jù)方差齊與否，再選擇相應(yīng)的統(tǒng)計分析方法。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)實驗結(jié)果

2.1.1穿梭箱實驗

和血益智方能明顯縮短VD大鼠主動逃避時間和遭受電擊時間，減少遭受電擊次數(shù)，與NS組比較有顯著性差異（P< 0.05）。但作用不如Sermion組。

2.1.2水迷宮實驗

經(jīng)過和血益智方治療30 d后，藥物組比NS組動物定位航行潛伏期縮短，游泳的路徑也縮短；在空間探索實驗中，30s內(nèi)大鼠穿越原目標(biāo)的次數(shù)增加。上述指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計分析均有顯著性差異。它們的游泳軌跡如圖1~5 。

2.2病理學(xué)檢測結(jié)果

光鏡下觀察：假手術(shù)組海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、CA4 區(qū)以及齒狀回等各區(qū)的分子層、錐體細胞層（顆粒細胞層）、多形細胞層之細胞排列緊密有序，顆粒細胞大小一致，核圓而大，邊界及核仁可見，神經(jīng)纖維排列整齊；NS組海馬CA1區(qū)細胞大小不規(guī)則，錐體細胞層層次減少，排列稀疏，細胞體積變大，有數(shù)量不等的小空泡，細胞核變

小，結(jié)構(gòu)不清，核仁消失，核固縮為三角形或多角形，神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯。其它各組海馬顆粒細胞層次有減少，但層數(shù)較模型組多，細胞排列比較密集、整齊有序，細胞缺失存在，核圓而大，邊界及核仁尚清楚，胞漿內(nèi)成分減少，神經(jīng)纖維排列不太整齊。組織病理切片提示模型組神經(jīng)元有損傷，用藥物治療后神經(jīng)元損傷有所減輕。海馬組織（HE染色，400倍）的病理切片如圖6~10。

3 討論

VD是繼發(fā)腦血管病變的中樞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能損害，導(dǎo)致患者認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、理解等能力下降。不同類型的記憶有不同的神經(jīng)結(jié)構(gòu)和回路參與，這些神經(jīng)結(jié)構(gòu)的血流減少或中斷，就會引起功能障礙，如不及時恢復(fù)血流，神經(jīng)細胞就會腫脹、死亡[2]。因此，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對VD的治療[3] 包括：①治療原發(fā)腦血管��；②改善腦功能。所用的藥物如思爾明為二氫麥角堿類藥，有α受體阻斷作用，能擴張顱內(nèi)腦血管，改善腦血流，有比較明顯的抗VD效果。 [4-6]

VD的證候與中醫(yī)的“呆病”、“文癡”、“健忘”、“善忘”等相當(dāng)，教授從臨床實踐觀察認(rèn)為VD以氣血虧虛、肝腎不足者居多，兼有痰瘀互病者亦不少見，治宜調(diào)和氣血、滋補肝腎。方中當(dāng)歸辛溫，血虛能補、血瘀能散，使氣血調(diào)和、各有所歸；川芎辛溫，活血解郁、行血中之氣；白芍微溫，和營滋陰，與當(dāng)歸、地黃同用為滋陰養(yǎng)血之良藥；生地甘寒養(yǎng)陰，與歸芍同用有補血生血之功；黃芪炙之則溫，大補元氣，填空補虛（髓），為補氣藥之長，與四物湯同用，起益氣養(yǎng)血之用；旱蓮草、女貞子甘寒補血，滋肝腎之陰；益智仁補腎益智；法夏則辛燥，降氣化濁，對本方中補氣養(yǎng)血藥起補而不滯，潤而不膩的作用，故和血益智方能調(diào)和氣血、滋補肝腎，填精生髓。

中藥藥理學(xué)研究表明川芎有擴張腦血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集的作用；黃芪、當(dāng)歸有促進骨髓造血、擴張血管的作用，當(dāng)歸還有穩(wěn)定細胞膜作用；生地能增加“陰虛”動物模型腦內(nèi)M-膽堿受體的結(jié)合位點，并且可促進“血虛”動物紅細胞、血色素的恢復(fù)，有顯著的“生血”作用；白芍有抗血小板聚集作用。黃芪對雙側(cè)頸動脈結(jié)扎所致的動物腦缺氧有顯著對抗作用，可增加小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。和血益智方抗VD的確切機制與生物活性成分有待進一步研究。