第二代高通量藥物篩選平臺(tái)更容易發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇信號(hào)通路低親合力抑制劑

第二代高通量藥物篩選平臺(tái)更容易發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇信號(hào)通路低親合力抑制劑

EJ Dell1, JL Tardieu2, F. Degorce2, Michael Fejtl1

1 BMG LABTECH Inc. NC, USA edward.dell@bmglabtech.com

2 Cisbio Bioassays, 30200 Codolet, France

關(guān)鍵詞：高通量，藥物篩選，HTS，HTRF，Cisbio，BMG Labtech，PHERAstar FS，磷脂酰肌醇信號(hào)通路，低親合力，抑制劑，G-蛋白偶聯(lián)受體，GPCRs

摘要:

通過傳統(tǒng)的高通量藥物篩選平臺(tái)（HTS）所發(fā)現(xiàn)的可市場(chǎng)化的藥物不僅數(shù)量少，而且市面上大部分的藥物都是小分子量（<500Da）物質(zhì)。這似乎說明，運(yùn)行于更低體積和更低濃度下的傳統(tǒng)高通量藥物篩選平臺(tái)，錯(cuò)失了發(fā)現(xiàn)更低親合力藥物的機(jī)會(huì)。

市場(chǎng)的需求催生了下一代高通量藥物篩選平臺(tái)——來自德國(guó)BMG LABTECH公司的PHERAstar FS，以光電倍增管（PMT）檢測(cè)技術(shù)為核心的多功能微孔板檢測(cè)儀。與來自另一品牌在行業(yè)中處于領(lǐng)導(dǎo)地位的以CCD相機(jī)為技術(shù)核心的微孔板檢測(cè)儀進(jìn)行平行測(cè)試。數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測(cè)儀（PHERAstar FS）比CCD微孔板檢測(cè)儀具有明顯的性能優(yōu)勢(shì)：超過2倍的讀數(shù)速度已經(jīng)更加卓越的分析質(zhì)量參數(shù)。更重要的是，PMT微孔板檢測(cè)儀（PHERAstar FS）檢測(cè)出幾個(gè)CCD檢測(cè)儀不能發(fā)現(xiàn)的更低親合力的藥物“靶點(diǎn)”。PHERAstar FS，作為新的高通量藥物篩選的黃金標(biāo)準(zhǔn)，將是傳統(tǒng)高通量藥物篩選中用于發(fā)現(xiàn)低親合力復(fù)合物的代表性選擇。

數(shù)據(jù)顯示，PMT微孔板檢測(cè)儀與CCD微孔板檢測(cè)儀相比：

發(fā)現(xiàn)幾個(gè)更低親合力的藥物“hits”（活性化合物）

更好的Z’，分析窗和ΔF%

2倍以上的檢測(cè)速度

實(shí)例分析:

在這里，我們采用的是Cisbio公司生產(chǎn)的IP-One HTRF®分析——該方案檢測(cè)更低應(yīng)答的胞內(nèi)第二信使磷酸肌醇（IP1），磷酸肌醇是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。我們同時(shí)對(duì)比了兩種不同的高通量篩選微孔板檢測(cè)儀（PHERAstar FS和來自另外一個(gè)品牌的微孔板檢測(cè)儀）對(duì)磷脂酰肌醇信號(hào)通路低親合力抑制劑的檢測(cè)結(jié)果來評(píng)估兩種藥物篩選技術(shù)。

背景知識(shí):

G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)為跨膜蛋白，是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激信號(hào)的關(guān)鍵角色。GPCRs與胞內(nèi)一系列復(fù)雜的復(fù)合物相互作用調(diào)控非常大量的下游效應(yīng)物質(zhì)。其產(chǎn)物三磷酸肌醇(IP3)是其中一個(gè)第二信使，是對(duì)Gq-蛋白偶聯(lián)受體被激活的應(yīng)答而產(chǎn)生的。然而，IP3的半衰期非常短，對(duì)于藥物篩選而言，是很難對(duì)其進(jìn)行測(cè)定的。因此，對(duì)由IP3觸發(fā)的鈣釋放的監(jiān)測(cè)，作為該信號(hào)通路的下游信號(hào)被廣泛應(yīng)用。另外一個(gè)監(jiān)測(cè)IP3的方法是檢測(cè)磷酸肌醇（IP1）的累積，磷酸肌醇（IP1）是三磷酸肌醇（IP3）的下游代謝產(chǎn)物。

圖1.IP1的生物合成路徑

利用IP1的穩(wěn)定性和在細(xì)胞內(nèi)的可累積性的優(yōu)點(diǎn)，采用IP1單克隆抗體制備優(yōu)化的均相時(shí)間分辨熒光 (HTRF®)分析方法。HTRF® IP-One分析方法已經(jīng)與多種現(xiàn)存的方法相比較且得到相似的復(fù)合效能數(shù)據(jù)，且在終點(diǎn)累積的IP1可用于測(cè)定緩作用復(fù)合物的作用，這個(gè)是鈣流測(cè)定沒辦法做到的。HTRF® IP-One分析方法同時(shí)可通過定量組成性激活的G蛋白受體來測(cè)定反向激動(dòng)劑，這是測(cè)定鈣釋放的方法所不能做到的。最后一點(diǎn)，HTRF® IP-One檢測(cè)方法具有比鈣流檢測(cè)方法更好的分析穩(wěn)健度和更低的假陽性。IP-One分析方法是Cisbio Bioassays在其專利HTRF®技術(shù)上開發(fā)出來的。 (圖2).

該分析方法采用與IP1特異性結(jié)合的單克隆抗體，其原理是基于胞內(nèi)累積的IP1與其競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而抑制了HTRF®供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。建立一個(gè)IP1標(biāo)準(zhǔn)校正曲線可用于計(jì)算因復(fù)合物作用而引起的胞內(nèi)累積的IP1的濃度，從而相應(yīng)得到了復(fù)合物的濃度。

圖2: IP-One HTRF 分析原理圖

材料和方法:

黑色1536-孔微孔板，來自于Greiner公司

下一代PMT微孔板檢測(cè)儀——PHERAstar FS，來自于德國(guó)BMG LABTECH公司

高通量CCD微孔板檢測(cè)儀來自于另外生產(chǎn)商

       PHERAstar FS配備高能脈沖氮分子激光，發(fā)射波長(zhǎng)為337nm，同時(shí)配備了專用的同時(shí)雙發(fā)射（SDE）直接光子測(cè)定時(shí)間分辨熒光模式。當(dāng)激發(fā)鋱(Tb)受體分子時(shí)，激光比寬光波段的氙閃燈具有更高的效率。與銪(Eu)相比，激光的高能量使得激發(fā)峰在337nm左右的鋱穴合物有更高的分子激發(fā)效率。Greiner的1536-孔微孔板用于5μL體系的分析。如圖3所示，1408個(gè)不同的復(fù)合物移液到微孔板的前44列中，陽性對(duì)照(POS,n=64)和陰性對(duì)照(NEG, n=64)移液到最后4列中。

圖3: BMG LABTECH多功能酶標(biāo)儀PHERAstar FS

圖4: 1536-孔微孔板布局

結(jié)果與討論:

通過計(jì)算兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)(Em 665 nm / Em 620 nm) 下的HTRF®比率來評(píng)估分析結(jié)果， 1536微孔板的3維表面圖的尖峰表示得到的hits（活性化合物）。

圖5: 用PHERAstar FS測(cè)得的IP-One HTRF® 比率

圖6: 用CCD微孔板檢測(cè)儀測(cè)得的IP-One HTRF® 比率

當(dāng)對(duì)比同一塊微孔板在兩個(gè)儀器上讀數(shù)結(jié)果時(shí)，很明顯只有PHERAstar FS給出了陽性結(jié)果，而CCD微孔板檢測(cè)儀并沒有給出明顯的尖峰。

結(jié)論:

用現(xiàn)有的處于領(lǐng)導(dǎo)地位的CCD微孔板檢測(cè)儀不能發(fā)現(xiàn)的低親合力復(fù)合物用PMT微孔板檢測(cè)儀PHERAstar FS可以很容易的檢測(cè)出來。

相關(guān)介紹:

HTRF: HTRF^® 是均相時(shí)間分辨熒光技術(shù)的簡(jiǎn)稱，HTRF^® 技術(shù)是對(duì)TR-FRET技術(shù)的進(jìn)一步改良，提供了更高的靈敏度和穩(wěn)定性，為法國(guó)Cisbio公司的專利技術(shù)。Cisbio Bioassays是一家超過50年歷史的生命科學(xué)、醫(yī)療診斷和藥物研發(fā)公司。Cisbio Bioassays公司所銷售的基于HTRF技術(shù)的產(chǎn)品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk以及Tag-lite™細(xì)胞表面受體平臺(tái)。在眾多HTRF®的檢測(cè)儀器中，BMG LABTECH的PHERAstar FS為Cisbio公司的推薦儀器。

BMG LABTECH：BMG LABTECH是一家超過20年歷史的德國(guó)公司，多功能酶標(biāo)儀是其唯一專注的產(chǎn)品，其多功能酶標(biāo)儀以專業(yè)、高端而著稱于市場(chǎng)，是科研和藥物篩選的最佳選擇。特別是FLUOstar Omega（榮獲“2010年科學(xué)家的選擇之最佳藥物篩選產(chǎn)品”）以及PHERAstar FS（Cisbio公司推薦HTRF®檢測(cè)儀器）更是多功能酶標(biāo)儀領(lǐng)域的驕子。香港伯齊科技有限公司為BMG LABTECH在中國(guó)大陸和香港、澳門的唯一授權(quán)代理商。

采用Cisbio IP-One和PHERAstar FS相結(jié)合所發(fā)表的文章：

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9. Selective Orthosteric Free Fatty Acid Receptor 2 (FFA2) Agonists

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