制膠過程中需要注意的細(xì)節(jié)及操作指南

說到Western Blotting，估計(jì)所有技術(shù)員都會(huì)聯(lián)想到藍(lán)底上的黑色條帶，或者是儀器掃描的白底黑條圖片。經(jīng)過了漫長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)流程，得到的會(huì)是清晰的、符合實(shí)驗(yàn)理論的完美結(jié)果，或者更多的是其他讓自己略感失望的結(jié)局。

比起其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，Western Blotting實(shí)驗(yàn)似乎更加冗長(zhǎng)、更加考驗(yàn)技術(shù)，從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，到最后曝光結(jié)果，任何一個(gè)步驟的絲毫疏忽，結(jié)果可能就差之千里。

在這里，BioTNT我先放下之后繁瑣復(fù)雜的操作步驟，和大家聊聊Western Blotting實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)——制膠。

不要小看制膠這件小事哦！Western實(shí)驗(yàn)是從電泳跑膠開始的（之前的樣本處理算在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備里哈），因此電泳跑膠的質(zhì)量直接影響到最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量起到了決定性的作用。

要是在制膠時(shí)出現(xiàn)了瑕疵，會(huì)有怎樣的結(jié)果呢？

好不容易配好的分離膠在凝固時(shí)居然只剩下了一半！沒法用了，只能重制！那你一定是個(gè)新手，漏膠什么的最容易出現(xiàn)了。

曝光結(jié)束，發(fā)現(xiàn)條帶不在同一水平線上，原本應(yīng)在同一kDa值的條帶卻上上下下如同波浪線一般，好吧，那這塊兒膠在配制的時(shí)候一定不勻。悲劇，從頭開始吧！

還是在曝光結(jié)束，發(fā)現(xiàn)在垂直方向上有那么一小條出現(xiàn)了空白（或者說是黑色曝光細(xì)斑），不巧的，影響到了目的條帶。嗯，那就是你在制膠的時(shí)候混了那么一點(diǎn)兒小氣泡進(jìn)去，蛋白們?cè)谂苣z時(shí)碰到氣泡都繞道啦！

繼續(xù)的，曝光結(jié)束，發(fā)現(xiàn)目的條帶和非特異條帶擠作一團(tuán)，難舍難分，沒法作為數(shù)據(jù)，這種情況比較復(fù)雜，可能原因是電泳時(shí)間不夠，抗體質(zhì)量不佳，樣本中的蛋白過量，etc. 但是，你有沒有想過，可能是你選錯(cuò)了膠的濃度？

還有諸如膠不凝、曝光條帶大小不均、拔泳梳時(shí)壞膠、上樣電泳時(shí)樣本溢出等等問題，可能都與你制膠的小細(xì)節(jié)有問題哦！

怎么樣，小瞧了制膠，吃大虧了吧！還是好好的、嚴(yán)肅的來看待制膠這個(gè)問題吧！

說到這個(gè)制膠，很多的少年們還不知道制的是什么膠吧（啊喂，前面說了，是聚丙烯酰胺凝膠啦�。�？，在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，常用的電泳膠有兩種：瓊脂糖凝膠以及聚丙烯酰胺凝膠。這兩個(gè)凝膠有什么區(qū)別呢？咳咳，本質(zhì)區(qū)別啊！瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。其孔徑相當(dāng)大，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。也就是說，瓊脂糖凝膠，可以區(qū)分的是電荷量，以及大分子量的物質(zhì)。

著重介紹一下我們的聚丙烯酰胺凝膠，他是聚丙烯酰胺聚合交聯(lián)向成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。在電泳前，通過向樣品加入還原劑(打開蛋白質(zhì)的二硫鍵)和過量SDS（陰離子去垢劑），使蛋白質(zhì)變性解聚，并與蛋白質(zhì)結(jié)合成帶強(qiáng)負(fù)電荷的復(fù)合物，掩蓋掉蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異，使各種蛋白質(zhì)的電荷／質(zhì)量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子大小。也就是說，聚丙烯酰胺凝膠，可以區(qū)分的是分子量相對(duì)較小的物質(zhì)。

那么，聚丙烯酰胺凝膠里到底有些什么成分呢？

首先要說明的是，電泳時(shí)的聚丙烯酰胺凝膠其實(shí)是由兩塊（或者以上）不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠組合而成的，他們分別稱為濃縮膠及分離膠，濃縮膠是4%聚丙烯酰胺凝膠，主要作用是將樣本在上樣時(shí)的高度差縮小，使得所有的蛋白能夠處在同一起跑線上，進(jìn)而得到更美觀、更科學(xué)的數(shù)據(jù)。在部分實(shí)驗(yàn)室，并不用濃縮膠，這一做法不值得提倡哦！分離膠是真正的分子篩，通過聚丙烯酰胺形成的立體孔道，對(duì)不同分子量大小的蛋白進(jìn)行分離。在一些實(shí)驗(yàn)室，分離膠選用的是梯度膠，即為使用不同濃度的膠依次疊加，所得到的膠分離效果更佳，不過，制膠的步驟多了，失敗的可能性也大大增加哦！對(duì)于新手來說絕不推薦！

分離膠和濃縮膠中的成分基本相同，都是由以下這些組成：超純水、聚丙烯酰胺、Tris鹽酸、SDS、AP、TEMED。分別來說說它們的作用吧！

超純水：…不說了

聚丙烯酰胺：由丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N，N’一亞甲基雙丙烯酰胺(簡(jiǎn)稱Bis)按一定比例混合而成，分子篩作用，分離不同分子量大小的蛋白。順便一提哦，丙烯酰胺是劇神經(jīng)毒哦！操作時(shí)候可要特別當(dāng)心��！聚丙烯酰胺毒性相對(duì)較小，但是還是注意些吧！

Tris鹽酸：緩沖液，保證膠的pH值正常。

SDS：十二烷基硫酸鈉，陰離子去垢劑，打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋各種蛋白分子間天然的電荷差。

AP：過硫酸銨，催化劑，加速聚丙烯酰胺形成立體結(jié)構(gòu)，即加速凝膠。

TEMED：N，N，N’，N’四甲基乙二胺，催化劑，加速聚丙烯酰胺形成立體結(jié)構(gòu)，即加速凝膠。

在了解了這么多基本知識(shí)之后，我們終于可以制膠了吧！嘿，不！慢著！先想想，我們要制多少濃度的膠呢？不同的聚丙烯酰胺濃度所產(chǎn)生的分子篩作用不同，對(duì)之后的實(shí)驗(yàn)也會(huì)產(chǎn)生影響。常見的聚丙烯酰胺凝膠濃度有：8%、10%、12%（什么？梯度膠，咳咳，這里就不說了哈），視具體情況而定。

不同濃度的分離膠對(duì)相同范圍分子量大小的蛋白有不同的分離作用，由此可得出對(duì)不同分子量蛋白所適用的相應(yīng)濃度的分離膠。經(jīng)過我們大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到，8%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)35kDa以上蛋白的分離效果較好，對(duì)35kDa以下蛋白的分離效果較差；10%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)15-170kDa蛋白的分離效果普通，對(duì)15kDa以下蛋白分離效果較差；12%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)45kDa以下蛋白分離效果較好，對(duì)45kDa以上蛋白分離效果較差。

Western實(shí)驗(yàn)中，絕大部分蛋白的分子量在20-100kDa，因此在沒有特殊要求的情況下使用10%的聚丙烯酰胺凝膠，可以基本保證不同分子量蛋白的分離以及對(duì)電泳蛋白的最高利用。

好了好了，我們還是制膠吧！

制膠這事兒其實(shí)真是個(gè)手藝活兒，需要一定的熟練程度。剛開始制膠，制出了一兩塊兒廢膠，大家大可不必放在心上，想當(dāng)年，BioTNT可足足制了一天，才制出能夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的凝膠喲！

漏膠往往是每位技術(shù)員朋友最先遇到的問題，雖然制膠的制膠槽按照購買公司的不同也有所差別，但是總的來說大同小異，掌握手上的力度最為重要。對(duì)于制膠的新手，個(gè)人建議先別急著制膠，先把制膠器組裝起來，往玻璃槽中加水，等過25分鐘（即為膠凝固的時(shí)間），直到漏水現(xiàn)象基本解決后，就可以著手制膠了，一般來說，不漏水了，漏膠的可能就基本消除啦。在組裝制膠器的過程中，要經(jīng)常注意玻璃板底是否和制膠槽底是否平整，一旦不平整，漏膠的可能性就很大了喲。怎樣才能平整呢？這就是力度問題啦，用力不能太輕，同樣也不能過猛，太輕封不住，太猛就容易造成形變，這個(gè)度嘛，最后還是要自己找��！BioTNT的同事也告訴我呀，有條件的實(shí)驗(yàn)室，可以在制作聚丙烯酰胺凝膠前，先往玻璃槽里加一些瓊脂糖凝膠封個(gè)底，個(gè)人覺得也是不錯(cuò)的建議喲！

你以為不漏膠了，就算成功了？no，no，no！你還差得遠(yuǎn)呢！不要忘了，你剛剛到制膠這一步哦！

接下來，我就提幾個(gè)需要注意的點(diǎn)，剩下的大家就自己加油吧！

首先，在制備液態(tài)膠的時(shí)候，需要格外小心，不要加錯(cuò)或者漏加什么東西哦，配制的母液也盡量是新鮮配制，不要使用已經(jīng)保存很多時(shí)間的。配制好的液態(tài)膠需要充分的混勻，推薦的方式是上下溫和顛倒。之前介紹過，AP以及TEMED是聚丙烯酰胺的助凝劑，要是一不小心沒加，那你的膠可就凝不起來了喲（據(jù)說沒有這兩個(gè)東西凝膠要等個(gè)把星期哦，反正BioTNT是沒等過）！

其次，在加膠時(shí)，注意盡量不要加入氣泡。SDS是去垢劑，在混勻過程容易產(chǎn)生氣泡，而在膠中混入氣泡可是非常致命的喲！當(dāng)在混勻時(shí)，手法要溫和，混勻完后，將液態(tài)膠靜置15秒左右再進(jìn)行加膠，以使液態(tài)膠中的微小氣泡上浮。另外，加膠時(shí)可以使用兩檔吸一檔打的方式，防止在打完膠后打入空氣，同時(shí)也應(yīng)該注意槍頭是否有氣泡。

第三，壓膠時(shí)滴加壓膠液應(yīng)均勻、緩慢。壓膠是制膠時(shí)不可缺少的一步，平整的分離膠有助于得到平整的條帶。常見的壓膠液是異丙醇，也可以用超純水替代。壓膠不慎不僅不能壓平分離膠，反而會(huì)使分離膠凹凸不平，甚至直接溶入分離膠，造成膠的不勻。在滴加壓膠液時(shí)，應(yīng)貼住玻璃板，由左至右緩慢滴加，控制每一滴壓膠液的體積。

第四，應(yīng)注意掌握凝膠的時(shí)間及溫度。凝膠是一個(gè)化學(xué)反應(yīng)，與溫度、時(shí)間有一定關(guān)系。一般來說，當(dāng)室溫在10-25℃時(shí)，凝膠需要25分鐘，室溫較高時(shí)可酌情減少時(shí)間，相反的，室溫較低時(shí)需適當(dāng)增加。凝膠時(shí)間不足會(huì)造成膠不凝，而時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得拔泳道變得困難。

最后，在制作泳道時(shí)，要保持泳梳的垂直上下。在插泳梳時(shí)，將泳梳斜插會(huì)使得拔出困難，甚至造成壞膠（可能很大喲）。在拔泳梳時(shí)，斜拔會(huì)撬開玻璃板，這樣上樣可能會(huì)漏樣哦！其次，泳道要保持一定的高度，即加入的液態(tài)分離膠一定要足量，否則上樣時(shí)樣本溢出可就是板上釘釘啦！對(duì)了對(duì)了，拔梳子的時(shí)候不要忘記加電泳緩沖液哦！

嗯？成功了？恭喜你啦！那么治好的膠可以長(zhǎng)時(shí)間存放么？可以，但不是那么的長(zhǎng)哦，強(qiáng)烈建議當(dāng)日使用，要是必須延時(shí)存放，需加入足量（可以沒過膠體）的電泳緩沖液，放入4℃冰箱，注意！DO NOT FREEZEN！要是在使用的時(shí)候發(fā)現(xiàn)你的電泳緩沖液結(jié)冰了，你可就中招了，重新融化后的膠在上樣時(shí)非常容易漏樣哦！也就是說，在大冬天時(shí)，不但不應(yīng)該冷藏，反而應(yīng)該保溫！同時(shí)，建議的保存期不應(yīng)超過1周，每天都應(yīng)補(bǔ)充電泳緩沖液保持膠體濕潤(rùn)。

制完了膠，也就終于邁出了萬里長(zhǎng)征的第一步，接下來，才是正式的Western實(shí)驗(yàn)哦，不過，好的開始是成功的一半，有了一塊好膠，成功的實(shí)驗(yàn)也就有了良好的基礎(chǔ)，祝各位實(shí)驗(yàn)順利，得到自己希望的結(jié)果吧！