感受態(tài)專(zhuān)題：轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定

瀏覽次數(shù)：958　發(fā)布日期：2013-11-11　來(lái)源：上海北諾生物科技有限公司

1．目的

學(xué)會(huì)用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。

2．原理

利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再?gòu)倪@些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片斷的克隆菌落。

3．器材

旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣�。ɑ蚝銣厮″仯�，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無(wú)菌牙簽，搖菌管。

4．試劑

LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO₄，0.025mol/L Tris-Cl pH8.0）。

5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

無(wú)菌dd water，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/mL氨芐青霉素。

6．操作步驟

方法一：酶切鑒定

（1）在超凈工作臺(tái)中取3支無(wú)菌搖菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素），用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。

（2）在超凈工作臺(tái)中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨芐青霉素）的搖菌管中。用此法隨機(jī)取3個(gè)白色菌落，分別裝入3個(gè)搖菌管中。

（3）37℃搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。

（4）將提取到的3管質(zhì)粒樣品與空質(zhì)粒同時(shí)電泳，根據(jù)分子量判斷和選區(qū)有插入片段的質(zhì)粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來(lái)鑒定其上的外源插入片斷大小是否與預(yù)期相符。

（5）將經(jīng)過(guò)鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號(hào)找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進(jìn)行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒或進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，或取500mL菌液與500mL 65%甘油混合后-80℃保存。

（6）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

方法二：快速PCR篩選法

（1）在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取3個(gè)邊緣清晰的白色菌落，并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。

（2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。

dd water 16μl

10×PCR buffer（不含MgCl2） 2.5μl

25mM MgCl₂ 1.5μl

2.5mmol/L dNTP 2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）

10μmol/L Primer1 1μl（12.5-25pmoles）